单细胞RNA测序揭示剪接调控与自身免疫和炎症疾病的细胞类型特异性关联
单细胞RNA测序揭示外周血中细胞类型特异性剪接调控与自身免疫及炎症性疾病的关系
背景介绍
近年来，基因组研究的飞速发展带来了对复杂性状遗传基础的更深入认识。然而，对于大多数与复杂疾病相关的基因组关联位点（GWAS loci），它们的功能机制仍未完全解明。这些位点大多位于非编码基因组区域，而非直接编码蛋白质的区域。因此，理解转录后事件，例如选择性剪接（alternative splicing, AS），如何影响基因表达以及复杂疾病的遗传风险，显得至关重要。选择性剪接是调控基因功能和生成基因表达多样性的关键机制，而其在特定细胞类型和遗传背景中的作用目前研究较少。
此外，大规模的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术为无偏地检测单细胞层面的基因表达模式提供了契机。这种技术能解析异质人群中不同细胞类型的基因组调控特性。然而，传统scRNA-seq方法由于测序的3′端偏向性，限制了其对选择性剪接事件的探测深度。
为了弥补相关研究空白，来自亚洲多个研究机构的科研团队致力于探索外周血单核细胞（PBMCs）中选择性剪接及其与自身免疫和炎症性疾病遗传风险的关系。他们通过高效利用5′偏向的单细胞转录组测序技术，全面分析了剪接调控在细胞和遗传背景下的动态变化。
论文来源
这篇题为《Single-cell RNA sequencing of peripheral blood links cell-type-specific regulation of splicing to autoimmune and inflammatory diseases》的论文发表在2024年12月号《Nature Genetics》杂志上，由来自新加坡国立大学、RIKEN、三星医疗中心及其他多家研究机构的跨国协作团队完成。此项研究以亚洲种族多样性为基础，致力于通过单细胞水平剖析免疫相关疾病的遗传机制。
研究过程
数据生成与研究设计
研究团队从“亚洲免疫多样性图谱（Asian Immune Diversity Atlas, AIDA）”的数据集中获取了474名健康捐赠者的外周血样本，这些捐赠者来自东亚、东南亚和南亚地区的多个族裔（例如日本、新加坡和韩国）。每位个体平均采样约1,959个单细胞，总共生成近100万个单细胞转录组数据。通过5′偏向的scRNA-seq技术以及内源性mRNA随机裂解与端帽化（recapping）现象，研究显著扩展了转录组的外显子覆盖比例，使剪接变化得到更细粒度的解析。
数据生成之后，研究对32种PBMC亚型进行分类，并在单细胞和伪合成样本（pseudobulk）水平上分别分析了选择性剪接模式。他们分别在单个细胞和更大规模的伪合成细胞群中发现了多种外显子表达差异事件（DSEs）以及成千上万个剪接定量性状位点（splicing quantitative trait loci, sQTL）。
数据分析与实验方法
研究可分为以下几个关键步骤：
1. 细胞类型分类与选择性剪接事件的量化
通过基因表达模式，研究确定了34种PBMC细胞类型，其中包含21个细胞亚型的充足样本。分别在单细胞和伪合成水平上，通过“SpliZ”工具量化了每个细胞的选择性剪接事件。结果表明，相较于3′端偏向的传统scRNA-seq方法，新方法检测到的剪接基因数量增加了4倍以上。
2. 性别和种族对剪接的影响
研究发现，性别和种族差异对剪接有重要影响。例如，在特定T细胞亚型中，女性样本中FLNA基因的一种短剪接异构体显著高于男性样本。此外，通过分析族裔间DSEs，发现种族特异的剪接调控与人群中等位基因频率变化高度相关。例如，SPSB2基因剪接位点因rs11064437的等位基因差异显著改变，从而影响剪接位点的选择偏好。
3. cis-sQTL与trans-sQTL的检测
通过整合5′偏向的测序技术与先进的统计建模，研究识别了10,874个编码基因和703个长非编码RNA基因的cis-sQTL。此外，团队还发现607个trans-sgenes，这些基因受到远程位点的调控。特别地，他们揭示了一个T细胞亚型中特异的调控关系：HNRNPLL的表达影响PTPRC的剪接。
4. 关联分析与病理机制研究
研究通过进行关联分析，发现cis-sQTL效应在多种自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮和Graves病）的遗传风险中显著富集。例如，一个亚洲特异的5′剪接位点变异（rs74416240）会导致TCHP基因外显子4的失活性内含子保留，且与Graves病的遗传风险密切相关。实验通过迷你基因(minigene)验证了rs74416240如何通过破坏5′剪接位点直接影响剪接。
5. 动态剪接事件与B细胞发育的关系
研究揭示了B细胞发育过程中剪接事件的动态变化。无论是PAX5（B细胞特异性转录因子）的亚型比例变化、还是另一个关键基因PTPRC的剪接变化，均揭示了基因表达与细胞功能进程的联系。
研究结果与发现
主要研究发现
性别和种族特异性剪接调控
性别和遗传背景对外显子使用模式的影响显著，特别是与已知免疫功能相关的关键基因（如FLNA和SPSB2）。广泛的cis-sQTL和trans-sQTL
研究揭示了特定细胞类型中大范围存在的剪接调控信号。例如，HNRNPLL的表达在T细胞中通过转效应广泛重塑PTPRC的剪接结构。疾病-剪接遗传关联
多数cis-sQTLs被发现与自身免疫和炎症性疾病的遗传风险显著共定位。特别是亚洲中特异的Graves病风险基因（TCHP RS74416240）的致病机制得到了解析。B细胞发育中的动态剪接调控
B细胞发育被发现与多种关键基因剪接动态显著相关，这为进一步探索免疫细胞演化机制提供了新方向。
研究意义与亮点
该研究以单细胞分辨率解析了选择性剪接的种族和性别差异以及与疾病易感性的关系，具有以下重大意义： - 技术创新性：通过改进的5′单细胞RNA测序方法，大幅提高了外显子覆盖率和剪接事件检测能力。 - 族群多样性：以罕见的东南亚和南亚人群样本为研究主体，为GWAS基因组研究提供了前所未有的族群丰富度。 - 疾病机制的全新见解：鉴定了Graves病和系统性红斑狼疮等免疫病相关的关键剪接机制，深化了复杂疾病的遗传调控网络理解。
该研究不仅揭示了选择性剪接在免疫功能及疾病中的关键作用，还为单细胞剪接和遗传变异的深入研究提供了蓝图，为精准医学的发展奠定了基础。