LOXL1-AS1通过调控JAK2/STAT3信号通路促进胆管癌的进展

学术背景

胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）是一种源自胆管上皮的恶性肿瘤，具有显著的医学挑战。其发病率在地理上存在明显差异，特别在亚洲和南美洲较高。CCA的发生与多种因素相关，如胆囊炎、胆结石病、肝硬化及肝炎病毒感染等。由于其早期症状隐匿，许多患者在确诊时已处于晚期，导致手术切除效果不佳，预后极差。目前，对CCA发生机制的深入研究迫在眉睫，以便开发有效的靶向治疗方案，提高患者存活率及生活质量。长链非编码RNA（lncRNA）是一类超过200个核苷酸的RNA分子，因其不能编码蛋白质而得名。近来研究表明，lncRNA在多种生物过程中发挥关键调控作用，包括肿瘤的发生和发展。

来源

这项研究由黑龙江省哈尔滨医科大学附属第二医院的研究团队完成，主要作者包括Shaobo Yu, Xin Gao, Sidi Liu等。研究发表在2024年的《Cancer Gene Therapy》上（DOI: https://doi.org/10.1038/s41417-024-00726-2）。

研究流程

临床样品

收集了65对胆管癌患者的肿瘤组织及相应的非肿瘤组织样本。这些样本于2013年1月至2018年7月在哈尔滨医科大学附属第二医院采集，在手术后立即冷冻并存储于-80°C。所有患者均签署知情同意书，并获得伦理委员会批准。

细胞培养和转染

对正常胆管细胞系HIBEC和胆管癌细胞系CCLP-1、QBC939 、RBE 和HuCCT1进行培养和转染实验。通过转染siRNA和质粒来实现LOXL1-AS1的敲减和过表达。

qRT-PCR

提取细胞和组织样本中的总RNA，并将其逆转录为cDNA，随后进行qRT-PCR分析，检测目标基因的表达水平。

细胞存活实验

使用CCK-8和EdU实验评估细胞存活率，并通过JC-1实验评估线粒体膜电位。

细胞凋亡检测

通过TUNEL实验和流式细胞术检测细胞凋亡率。

细胞迁移与侵袭实验

使用划痕实验和Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。

蛋白质印迹

通过Western Blot实验分析JAK2/STAT3信号通路相关蛋白质的表达情况。

亚细胞定位实验

通过亚细胞分离实验和FISH实验确定LOXL1-AS1在细胞中的定位。

RNA拉钩实验

通过RNA拉钩实验和RIP实验验证LOXL1-AS1与JAK2蛋白的相互作用。

体内实验

在裸鼠中建立皮下肿瘤及转移模型，通过H&E染色及免疫组化分析进行评估。

主要结果

LOXL1-AS1在CCA中的高表达

在胆管癌组织中发现LOXL1-AS1的显著过表达 (图1a)。这种高表达与TNM分期、淋巴结转移及患者预后显著相关（图1b-1e）。通过Kaplan-Meier方法及ROC曲线评估，LOXL1-AS1与CCA患者的DFS和OS密切相关（图1f）。

LOXL1-AS1对肿瘤增殖和凋亡的调控

通过CCK-8和EdU实验，发现敲减LOXL1-AS1显著抑制胆管癌细胞的增殖（图2c-2d），而过表达LOXL1-AS1则促进其增殖。TUNEL和JC-1实验显示，敲减LOXL1-AS1显著促进胆管癌细胞的凋亡（图2e-2f）。在小鼠体内实验中，敲减LOXL1-AS1显著抑制肿瘤生长（图2g-2h）。

LOXL1-AS1对迁移和侵袭的影响

通过划痕实验和Transwell实验，敲减LOXL1-AS1显著抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭能力（图3a-3c）。EMT标志物的表达分析显示，LOXL1-AS1与EMT过程的启动密切相关（图3d）。体内实验表明，敲减LOXL1-AS1显著减少肝肺转移（图3e-3f）。

LOXL1-AS1调控JAK2/STAT3信号通路

实验发现LOXL1-AS1主要定位于细胞质中（图4a-4b）。进一步的生物信息学分析和实验结果表明，LOXL1-AS1通过调控JAK2的磷酸化状态，进而影响JAK2/STAT3信号通路（图4c-4d）。

LOXL1-AS1影响JAK2的泛素化降解

通过RNA拉钩和RIP实验验证了LOXL1-AS1与JAK2的直接结合（图5a-5b）。敲减LOXL1-AS1后，JAK2蛋白的降解加速，而使用蛋白酶体抑制剂MG132后，JAK2蛋白降解受阻（图5d-5e）。进一步的CO-IP实验表明，敲减LOXL1-AS1可显著增加JAK2的泛素化水平（图5f）。

YY1转录因子与LOXL1-AS1的关系

生物信息学预测和实验验证显示YY1通过结合LOXL1-AS1上游启动子E1和E2位点，主要通过E2位点调控LOXL1-AS1的表达（图7a-7c）。敲减LOXL1-AS1对CCA细胞功能的影响可以被YY1的过表达所逆转（图7d-7i）。

讨论及结论

研究表明，LOXL1-AS1在胆管癌中高表达，且与临床病理特征和患者预后显著相关。LOXL1-AS1通过抑制JAK2的泛素化降解，激活JAK2/STAT3信号通路，促进CCA的发展。YY1转录因子通过调控LOXL1-AS1的表达进一步影响CCA的恶性生物学特性。这些发现为进一步了解CCA的发病机制及开发新的治疗策略提供了重要线索。研究提示需要进一步探索LOXL1-AS1与其他分子间的相互作用及其在其它信号通路中的作用，以期在更大患者群体中验证其临床意义。