年龄相关的HAPLN1丧失通过间接上调黑色素瘤内皮细胞ICAM1破坏血管完整性

在2024年3月发表于《Nature Aging》上的一篇题为《Age-dependent loss of HAPLN1 erodes vascular integrity via indirect upregulation of endothelial ICAM1 in melanoma》的研究文章揭示了一项重要的研究成果。这项研究由Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health生化与分子生物学系的Gloria E. Marino-Bravante和Ashani T. Weeraratna领导的团队完成，旨在探讨年龄相关的黑色素瘤微环境中HAPLN1（Hyaluronan and Proteoglycan Link Protein 1）的丧失如何影响血管完整性及其潜在的治疗策略。

研究背景

黑色素瘤是美国第五大最常诊断的癌症，且是最致命的皮肤癌。统计数据显示，仅在美国，每年预计有7990人死于黑色素瘤。随着年龄的增长，黑色素瘤的预后显著恶化，55岁以上患者的疾病复发时间显著缩短，影响五年生存率。尽管内在年龄对癌症进展的影响早已被认识，但对其复杂机制的理解仍在不断深化。研究发现，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的许多成分，如血管，对癌症进展具有重要作用。因此，理解衰老和黑色素瘤进展之间的关系对于开发新疗法具有重要意义。

研究目的

此前的研究表明，黑色素瘤相关的血管中HAPLN1的减少会减慢癌症的进展。HAPLN1是皮肤真皮中一个重要的细胞外基质蛋白，其减少被证明会导致黑色素瘤血管的完整性受损，从而增加血管通透性。该研究的主要目的是探讨HAPLN1在老年患者黑色素瘤微环境中对血管内皮细胞ICAM1（Intercellular Adhesion Molecule 1）的间接作用，以及ICAM1对黑色素瘤进展的影响。

研究方法

该研究通过一系列实验技术，详细探讨了HAPLN1丧失在黑色素瘤微环境中的作用及其机制。这些技术包括免疫组化（IHC）、二次谐波生成成像（SHG）、电阻抗检测（Impedance-Based Assays）、以及免疫完全的同源小鼠研究。

工作流程

研究包括多个程序：

1. 小鼠模型的建立与处理：

   • 使用young syngeneic melanoma (YUMM1.7)细胞在年轻（6-8周）和老年（>52周）小鼠中建立黑色素瘤模型。
   • 通过皮下注射重组人HAPLN1（rHAPLN1）或PBS对老年小鼠进行处理，观察其对肿瘤内血管化的影响。

2. 体外细胞培养与基质处理：

   • 在人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）中进行3D血管生成球实验，通过嵌入由纤维母细胞重组的胶原基质中，比较HAPLN1高低环境下该球的血管生成潜力。

3. 蛋白表达及血管壁完整性检测：

   • 检测HUVECs在不同基质上的VE-cadherin（血管内皮钙粘蛋白）的表达情况，以确定血管壁的完整性。通过体外模拟检测电阻抗、FITC-Dextran漏液实验等评估内皮细胞屏障功能。

4. ICAM1的表达与阻断试验：

   • 检测ICAM1的表达，评估其在调控血管通透性中的作用。通过体内注射ICAM1阻断抗体观察其对黑色素瘤生长和转移的影响。

样本与技术

在这些过程中，样本数量从每组3-12个不等，并使用了包括免疫组化、免疫荧光、实时定量PCR (qRT-PCR)、蛋白质谱分析等多种实验技术，还结合了多种基因敲低策略（如使用shRNA敲低HAPLN1）。

数据分析

数据分析涉及计算图像中蛋白表达的相对强度和统计学处理，使用GraphPad Prism v9软件进行各种统计检验，如t检验、ANOVA和非参数Mann-Whitney测验等。

研究结果

1. HAPLN1对血管生成及基质的影响：

   • HAPLN1低水平环境（老年或年轻小鼠敲低HAPLN1）中，HUVECs的血管生成潜力显著增加，而在HAPLN1高水平环境（年轻或老年+HAPLN1重组处置）中显著减少。
   • 免疫组化数据显示，老年小鼠肿瘤中纤维连接蛋白（Fibronectin）水平显著高于年轻小鼠，而HAPLN1重组处理可以显著降低纤维连接蛋白水平。

2. VE-cadherin表达与基质刚度：

   • 在HAPLN1高水平的基质上培养的内皮细胞表现出更高的VE-cadherin水平，而在HAPLN1低水平基质上的细胞则表现出较低的VE-cadherin水平，表明HAPLN1对血管壁完整性上的重要作用。
   • 电阻抗检测显示，内皮细胞在HAPLN1高水平基质上形成的单层细胞电阻值较高，表明其屏障功能得到改善。

3. ICAM1的作用：

   • qRT-PCR和西方印迹分析发现，ICAM1在HAPLN1低水平基质上的表达显著增加，推测ICAM1的上调会降低VE-cadherin表达从而影响血管通透性。
   • 体内注射ICAM1抗体的老年小鼠，其肿瘤大小显著减小，转移也显著减少，进一步确认ICAM1在黑色素瘤进程中的关键作用。

研究意义

研究结论表明，HAPLN1丧失通过增加基质刚度，间接上调ICAM1，导致血管通透性增加，进而促进黑色素瘤转移。这一结果为理解年龄相关的肿瘤微环境改变提供了新的视角，并表明通过靶向ICAM1可以在一定程度上抑制黑色素瘤的进展，特别是对老年患者而言。

研究亮点

• 发现了HAPLN1通过基质依赖性的间接机制上调ICAM1，影响血管完整性。
• 提出了针对ICAM1的治疗策略有望改善老年黑色素瘤患者预后的新见解。
• 通过体内外多重实验验证了HAPLN1在调控黑色素瘤微环境中内皮细胞功能的作用。

这些发现不仅拓宽了年龄相关肿瘤生物学的理解，也为开发新的靶向治疗提供了重要线索。未来需要进一步探讨在不同肿瘤类型及临床环境中的适用性和有效性。