La mutation faux-sens du gène AIFM1 entraîne un dysfonctionnement mitochondrial et une intolérance à la carence en riboflavine

Contexte de la recherche

Les mitochondries sont des organites à double membrane présents dans les cellules eucaryotes nucléées, qui produisent principalement de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative pour fournir de l’énergie cellulaire. Les mitochondries possèdent leur propre génome, codant pour 13 protéines impliquées dans les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, tandis que les autres protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire et importées dans les mitochondries. Parmi elles, le facteur d’induction de l’apoptose (Apoptosis-Inducing Factor, AIFM1) est une flavoprotéine mitochondriale codée par le gène AIFM1 lié à l’X, impliquée dans la mort cellulaire indépendante des caspases et régulant la biogenèse des complexes de la chaîne respiratoire.

Des études ont montré que les mutations du gène AIFM1 sont associées à divers phénotypes cliniques, mais l’efficacité du traitement à la riboflavine (vitamine B2) reste controversée. Cette étude vise à explorer le mécanisme par lequel la mutation c.1019T > C du gène AIFM1 entraîne un dysfonctionnement mitochondrial et à évaluer l’effet de la supplémentation en riboflavine sur cette mutation.

Source de la recherche

Cette étude a été menée conjointement par des chercheurs de l’Institut de recherche sur les maladies neuromusculaires et neurodégénératives de l’hôpital Qilu de l’Université du Shandong, du laboratoire de médecine mitochondriale de l’hôpital Qilu (Qingdao) de l’Université du Shandong, de l’Institut de recherche en neurosciences de l’Université du Shandong, de l’hôpital affilié à l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Shandong, et d’autres institutions. Les principaux auteurs incluent Zhao Ying, Lin Yan, Wang Bin, Liu Fuchen, entre autres. Les résultats de la recherche ont été reçus le 23 mai 2023, acceptés le 9 août 2023 et publiés en ligne le 21 août 2023 dans “Neuromolecular Medicine”.

Méthodes et procédures de recherche

Sujets d’étude

Le sujet de l’étude était un garçon de 7 ans hospitalisé pour une démarche anormale, présentant une ataxie cérébelleuse, une neuropathie sensori-motrice axonale et une faiblesse musculaire, sans antécédents familiaux significatifs. Après approbation du comité d’éthique, un séquençage de l’ADN du génome entier et une analyse histologique ont été réalisés sur le garçon et ses parents.

Analyse génomique et des acides aminés

L’ADN génomique total a été extrait du sang périphérique et un dépistage génétique des maladies neurologiques a été effectué par séquençage de nouvelle génération (NGS). La mutation a été confirmée par séquençage Sanger et vérifiée au sein de la famille. L’analyse de conservation des acides aminés a été réalisée à l’aide de MutationTaster.

Histologie musculaire et études immunohistochimiques

Une biopsie du biceps a été réalisée sur le patient, et des coupes congelées de 8 μm d’épaisseur ont été soumises à une série de colorations histochimiques et immunohistochimiques, incluant l’hématoxyline-éosine (HE), la coloration trichrome modifiée de Gomori (MGT), la coloration de la cytochrome C oxydase (COX), etc. De plus, une coloration immunohistochimique avec un anticorps anti-AIFM1 (17984-1-AP, Proteintech) a été réalisée sur les coupes musculaires.

Culture de fibroblastes

Des fibroblastes cutanés primaires ont été obtenus à partir d’une biopsie cutanée et cultivés selon des méthodes standard. Les fibroblastes ont été cultivés dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine. Pour les études de carence en riboflavine, un milieu DMEM personnalisé sans riboflavine a été utilisé. Pour les études de supplémentation en riboflavine, des volumes égaux de solutions de riboflavine à différentes concentrations ont été ajoutés.

Western Blotting

Les échantillons musculaires et les fibroblastes cutanés ont été lysés et quantifiés pour leurs protéines. 30 μg de protéines de chaque échantillon ont été chargés et séparés par SDS-PAGE dénaturante à 12%, puis transférés sur une membrane PVDF. L’immunoblotting a été réalisé avec des anticorps primaires contre AIFM1, un cocktail d’anticorps OXPHOS et d’autres sous-unités des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale.

Mesure du taux de consommation d’oxygène

Le taux de consommation d’oxygène des fibroblastes a été mesuré à l’aide d’un analyseur Seahorse Bioscience XFe24. La production d’ATP, la respiration maximale et la respiration non mitochondriale ont été mesurées après l’ajout de différents inhibiteurs et découplants.

Mesure du potentiel de membrane mitochondriale

Le potentiel de membrane mitochondriale (Δψm) a été détecté à l’aide du colorant mitochondrial spécifique JC-1, observé sous microscope à fluorescence et quantifié.

Détermination de l’apoptose

L’apoptose des fibroblastes a été mesurée par coloration TUNEL, observée à 488 nm d’excitation et 530 nm d’émission. L’induction de l’apoptose a été réalisée après traitement à la Staurosporine.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide des logiciels SPSS 24.0 et GraphPad Prism 8. Les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les données ont été analysées par test t de Student unilatéral, avec une valeur p < 0,05 considérée comme statistiquement significative.

Résultats de la recherche

Identification de la mutation du gène AIFM1

Le séquençage de l’ADN génomique a révélé une mutation faux-sens c.1019T > C dans le gène AIFM1 chez le patient. L’analyse de conservation des acides aminés a montré que la séquence contenant ce site est hautement conservée chez plusieurs espèces, et que la mutation entraîne un changement d’acide aminé de méthionine à thréonine (p. Met340Thr). Selon les directives de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), cette mutation a été classée comme “probablement pathogène”.

Anomalies mitochondriales

La biopsie du biceps du patient a montré une variabilité de la taille des fibres musculaires. La coloration MGT a révélé de petites zones sous-sarcolemmiques rouges, indiquant une agrégation anormale des mitochondries. La coloration COX a montré quelques fibres à COX réduite, et la double coloration SDH/COX a confirmé la présence d’anomalies mitochondriales par des fibres bleues anormales. La coloration ATPase a montré un léger phénomène de réinnervation.

Diminution de l’expression d’AIFM1 et des sous-unités des complexes mitochondriaux

Les résultats de coloration immunohistochimique et de Western Blot ont montré une diminution significative de l’expression d’AIFM1 dans le tissu musculaire et les fibroblastes cutanés du patient. De plus, l’expression de la sous-unité NDUFB8 du complexe I et de la sous-unité CYTB du complexe III était significativement réduite dans le tissu musculaire.

Dysfonctionnement de la respiration mitochondriale

L’analyse par Seahorse a montré une diminution significative de la respiration basale, de la production d’ATP, de la fuite de protons, de la respiration maximale et de la capacité respiratoire de réserve dans les fibroblastes du patient. La respiration médiée par les complexes I, II et IV était significativement réduite dans les cellules mutantes.

La carence en riboflavine induit une régulation négative d’AIFM1

Dans des conditions de carence en riboflavine, les niveaux d’AIFM1 ont progressivement diminué dans les fibroblastes mutants et de type sauvage, avec une diminution plus marquée dans les cellules mutantes. Des concentrations élevées de riboflavine (2 et 20 mg/L) ont pu partiellement augmenter les niveaux d’AIFM1.

Amélioration des symptômes cliniques

Après 10 mois de traitement avec 100 mg de riboflavine par jour, le patient a montré une amélioration significative de l’ataxie et de la faiblesse musculaire, avec une amélioration de 19% de son score international d’évaluation de l’ataxie (ICARS).

Conclusion

Cette étude confirme la pathogénicité de la mutation c.1019T > C du gène AIFM1, qui entraîne un dysfonctionnement mitochondrial et une intolérance à la carence en riboflavine dans les cellules porteuses de cette mutation. La supplémentation en riboflavine aide à maintenir les niveaux de la protéine AIFM1 et la fonction respiratoire mitochondriale. Un traitement précoce à la riboflavine pourrait avoir une valeur thérapeutique pour les patients porteurs de mutations AIFM1.

Importance de la recherche

Cette étude fournit de nouvelles preuves scientifiques sur les maladies mitochondriales causées par des mutations du gène AIFM1, souligne l’importance d’un traitement précoce à la riboflavine et offre des références pour les futurs traitements cliniques.