遺伝性難聴における遺伝的多様性：キノシリア蛋白TOGARAM2の潜在的役割

2024-08-06 Tue
遺伝的異質性遺伝性難聴 TOGARAM2 候補遺伝子バイオインフォマティックス分析蝸牛の毛細胞二重聴覚損失
遺伝性聴覚障害における遺伝子の多様性：繊毛タンパク質TOGARAM2の潜在的役割背景
聴覚障害（Hearing Loss, HL）は多様な原因を持つ特徴であり、現在の研究では200以上の遺伝子における病原性変異がHLに関連していることが明らかになっています。広範な研究にもかかわらず、3分の1以上の家族で原因を特定できていないことが、遺伝子分析に大きな課題をもたらしており、特に多遺伝子家族で顕著です。複数の異なる遺伝子変異が、同じ家系の異なる個人でも異なる原因をもたらす可能性があります。したがって、より多くの潜在的な難聴の原因変異を見つけることが極めて重要です。
論文の出典
この研究はMemoona Ramzan、Mohammad Faraz Zafeer、Clemer Abad、Shengru Guoらの研究者によって行われ、米国マイアミ大学、ドイツのゲッティンゲン大学などの機関に所属しています。論文は2024年2月19日の「European Journal of Human Genetics」に掲載され、詳細な文献DOIは10.1038/s41431-024-01562-6です。
研究目的
本研究の目的は、4つの多遺伝子家族のエクソームまたは全ゲノムシーケンシングを通じて、既知または新規の難聴候補遺伝子に隠れた他の変異を同定することです。特に、TOGARAM2変異が常染色体劣性非症候性HLの潜在的な原因としての役割を、家族内での存在、蝸牛での発現、および蝸牛有毛細胞でのタンパク質局在を示すことで、これらの変異の病原性を明確にすることを目指しています。
研究方法
倫理声明と研究参加者
4つの家族が、聴覚障害に関連する遺伝子を特定することを目的とした国際的な共同研究コホートの一部となりました。研究は複数の機関の倫理委員会の承認を得ており、すべての参加者から書面による同意を得ています。未成年参加者の場合は、親が同意書を提供しました。成人の聴力検査は防音室で行われ、未成年者の聴力検査は標準的な手順に従って実施されました。
遺伝子解析
まず、各家族の影響を受けたすべてのメンバーに対してGJB2（MIM 121011）の両アレル変異スクリーニングを行いました。各家族の発端者にエクソームシーケンシング（Exome Sequencing, ES）を実施し、一部の影響を受けた個体には全ゲノムシーケンシング（Genome Sequencing, GS）を行いました。ゲノムデータはヒトGRCh37/hg19ゲノムアセンブリに対してマッピングされ、変異の呼び出しはGATKソフトウェアパッケージを使用して行われました。既知の難聴遺伝子における一塩基多型、挿入欠失変異、およびコピー数変異（Copy Number Variants, CNVs）の分析は自家製ソフトウェアを使用して行われました。一部の未解決の家系メンバーはGSによってさらに分析されました。
HEK293細胞でのTOGARAM2変異の生成
特定のTOGARAM2変異c.1543C>T (p.Gln515Ter)を生成するために、HEK293細胞で特異的gRNAと修復ドナーをIDT社から購入し、編集を行いました。4D-Nucleofectorシステムを使用して細胞エレクトロポレーションを行い、TOGARAM2変異細胞の生成と確認に成功した後、Sangerシーケンシングで検証しました。
定量的逆転写PCR（qRT-PCR）
3つの単一クローン正常対照と3つの単一クローンTOGARAM2 (c.1543C>T)ノックイン細胞からRNAを抽出し、cDNAに逆転写しました。SYBR Green色素を使用してmRNA発現分析を行い、HPRT1を内部対照として使用しました。
主な結果
4つの家族のすべてのメンバーが先天性または言語習得前の持続的な両側性重度から極度の重度HLを示しました。家族1596では、3人の影響を受けた兄弟姉妹がMARVELD2遺伝子のc.1331+2 T>C変異のホモ接合体であることが判明しましたが、この変異を示さなかった残りのメンバーには全ゲノムシーケンシングによってTECTA遺伝子のc.569 C>T (p.Thr190Met)新規変異が同定されました。
家族2503では、SLC26A4遺伝子のc.1334 T>G (p.Leu445Trp)変異が、すべての影響を受けたメンバーのHL症状を説明できないことが分かりました。さらなるエクソームシーケンシングにより、SOX10遺伝子のc.89G>T (p.Ser30Ter)も原因の一つである可能性が示されました。
また、家族2450では、影響を受けた兄弟姉妹の1人でMYO15A遺伝子のc.4441 T>C (p.Ser1481Pro)変異が発見されました。この変異を持たない兄弟姉妹に全ゲノムシーケンシングを行い、TOGARAM2遺伝子のc.1543 C>T (p.Gln515Ter)変異が同定され、この変異がナンセンス媒介mRNA分解（NMD）を引き起こす可能性が推測されました。
研究結論
本研究は、多遺伝子家系の各影響を受けたメンバーを個別に分析することが、既知および新規候補遺伝子における病原性変異を同定するための効果的な方法であることを示しています。特に、TOGARAM2遺伝子変異の蝸牛有毛細胞における局在と機能が難聴の発症メカニズムにおいて重要な役割を果たす可能性があることが発見され、この遺伝子の将来の研究および臨床応用における可能性が強調されました。
研究のハイライト
この研究のハイライトには以下が含まれます：
1. 複数の難聴遺伝子変異とHLの関連を同定し、遺伝性聴覚障害の理解を促進しました。
2. TOGARAM2遺伝子の難聴候補遺伝子としての可能性を示しました。
3. TOGARAM2が蝸牛有毛細胞に局在することを支持する新たな証拠を提供しました。
重要な意義
この研究は、科学的研究に新たな洞察を提供し、遺伝性難聴のメカニズム解明を助けただけでなく、臨床遺伝子診断と治療に貴重な情報をもたらしました。これらの発見は、個別化医療の発展を促進し、遺伝性聴覚障害の臨床管理とカウンセリングのレベルを向上させる可能性があります。