原発性家族性脳石灰化症患者における上流開放読取枠導入変異

2024-08-06 Tue
原発性家族性脳石灰化症遺伝的変異 5' UTR タンパク質の発現レポーターアッセイ病原性変異遺伝学的診断
研究背景及び問題提起原発性家族性脳石灰化症（Primary Familial Brain Calcification, PFBC）は、基底核やその他の脳領域の微小血管の石灰化を特徴とする稀な神経系疾患です。現在、少なくとも6つのPFBC関連遺伝子（SLC20A2、XPR1、PDGFB、PDGFRB、MYORG、JAM2を含む）が同定されていますが、50%以上の患者の病因はまだ不明です。これらの未解明の症例には、既知の遺伝子の非コード領域に隠れた変異が含まれている可能性があります。
研究者らは、5’非翻訳領域（untranslated region, UTR）の変異がAUGコドンを導入し、mRNAの翻訳を開始させ、一部のPFBC遺伝子の機能喪失を引き起こす可能性があると仮説を立てました。この仮説を検証するため、研究チームはPFBC関連の113のプローブのエクソームシーケンシングデータを再注釈し、PDGFB遺伝子の5’UTRに2つの上流AUG導入変異を発見しました。
論文の出典及び著者紹介“Upstream open reading frame-introducing variants in patients with primary familial brain calcification”と題されたこの論文は、Anne Rovelet-Lecrux、Antoine Bonnevalle、Olivier Quenezらの学者によって執筆され、研究チームは主にフランスのUniv Rouen Normandie、INSERM U1245、CHU Rouenなどの機関から構成されています。この論文は2024年の《European Journal of Human Genetics》に掲載され、論文の責任著者はGaël Nicolasです。
研究プロセス研究手順及び対象患者選択とエクソームシーケンシング：
研究チームはフランスで多施設の国家レベルの患者募集を行い、エクソームシーケンシングを実施しました。選択された患者は以下の基準を満たす必要がありました：脳石灰化の程度が年齢関連の閾値を超え、血液中の副甲状腺ホルモン、リン、カルシウムの含有量が正常であること。
データの再注釈及び変異スクリーニング：
5UTRとUTR注釈ツールを使用して、既知の病原性変異のない113名のPFBC患者のエクソームデータを再注釈し、PDGFB遺伝子の5’UTRに2つの変異を選別しました。
変異の機能検証：

GFPレポーター遺伝子システムを用いて、変異がタンパク質発現に与える影響を評価しました。2つの変異がGFPタンパク質の発現レベルを著しく減少させることが分かりました。
臨床遺伝子共分離性分析：
Sangerシーケンシングを通じて、これらの変異がPFBC患者の家系内で遺伝的に共分離することを確認しました。
サンプル及び実験方法サンプル： 既知の病原性変異のない113名のPFBC患者。
シーケンシングカバレッジ： Agilentのv5、v5+UTR、v6+UTRキャプチャーキットを使用してシーケンシングを行い、すべての関心遺伝子の5’UTR領域の高いカバレッジを確保しました。
レポーター遺伝子システム：
in vitro実験用のHEK293細胞に、異なるPDGFB 5’UTR変異を含むGFPプラスミドをトランスフェクションしました。
Western BlotとqPCRを用いてGFPの発現レベルを分析しました。
主な結果2つの病原性変異の発見c.-373C>G変異：
この変異は家系内で共分離性を示し、機能的な上流オープンリーディングフレーム（uORF）を形成すると予測され、通常のPDGFBの翻訳を抑制しました。
c.-318C>T変異：
これは単純症例で発見された変異で、オーバーラッピングフレームシフトオープンリーディングフレーム（oORF）を引き起こすと予測され、同様にタンパク質発現に著しい影響を与えました。
実験検証結果Western BlotとqPCR結果：
変異c.-373C>GとC.-318C>Tは、どちらもGFPシステムでタンパク質レベルを著しく低下させました。
Western Blotでは、c.-318C>T変異が予想よりも大きなGFPタンパク質を生成し、新しい開始コドンAUGが効果的に利用されたことを示しました。
結論及び意義この研究は、PDGFB遺伝子の5’UTRにおける上流AUG導入変異がPFBCの潜在的な病因メカニズムであることを示しています。このメカニズムは、機能的なuORFとフレームシフトoORFの導入により、翻訳を抑制するか、非機能的タンパク質の生成を引き起こします。これは未解明のPFBC患者に新たな診断方向を提供し、非コード領域の変異の再注釈と検出の重要性を強調しています。
研究のハイライト革新的な仮説： 5’UTR変異によるAUGコドン導入がPFBCを引き起こす新しいメカニズムを提案しました。
実験的検証： GFPレポーターシステムを通じて変異の機能的影響を検証し、その病原性を確認しました。
臨床応用価値： 未解明のPFBC症例に新たな病因遺伝子スクリーニングの方向性を提供し、医療従事者に非コード領域の変異を見逃さないよう注意を促しました。
その他の重要な情報本論文はまた、全ゲノムシーケンシングを行う前に、既存のエクソームシーケンシングデータを再注釈して変異をスクリーニングすることの重要性を強調しています。コード領域の変異は少数であっても著しい病原性を持つ可能性がありますが、稀な非コード領域の変異も同様に重要な役割を果たす可能性があります。したがって、今後の研究では、サンプルサイズを拡大して他のPFBC遺伝子における潜在的な非コード領域の病原性変異を確認する必要があります。