MINFLUX荧光纳米显微镜在生物组织中的应用
MINFLUX 纳米显微镜在生物组织中的应用：突破荧光显微镜的分辨率限制
学术背景
荧光显微镜在生物学研究中扮演着至关重要的角色，但其分辨率受到衍射极限的限制，通常只能达到约200纳米。近年来，超分辨率显微镜（super-resolution microscopy, SR）技术的发展突破了这一限制，使得研究人员能够在纳米尺度上观察生物分子的分布。然而，在复杂的生物组织中，尤其是较厚的样本中，光学像差、光的吸收和散射等问题严重影响了超分辨率显微镜的性能。为了在生理相关的环境中实现纳米级分辨率的蛋白质分布可视化，研究人员一直在探索新的成像技术。
MINFLUX（minimal photon fluxes）纳米显微镜是一种新兴的光学成像技术，它结合了坐标靶向和坐标随机超分辨率显微镜的优点，能够在极低的光子通量下实现纳米级分辨率的荧光成像。然而，将MINFLUX技术应用于较厚的生物组织样本，尤其是脑组织切片，仍然面临诸多挑战。本文的研究旨在探索MINFLUX技术在生物组织中的成像性能，特别是在较深组织中的纳米级分辨率成像。
论文来源
本文由Thea Moosmayer、Kamila A. Kiszka等研究人员共同撰写，研究团队来自德国马克斯·普朗克多学科科学研究所（Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences）、哥廷根大学（University of Göttingen）等机构。论文于2024年12月20日发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上，题为“MINFLUX fluorescence nanoscopy in biological tissue”。
研究流程与结果
1. 实验设计与设备改进
为了在生物组织中进行MINFLUX成像，研究团队对现有的MINFLUX显微镜进行了多项改进。首先，他们采用了硅油浸没物镜，以提高折射率匹配并减少像差。其次，他们开发了一种深度可调的焦点锁定系统，能够在不同深度下稳定样本位置，确保纳米级精度的定位。此外，研究团队还引入了渐进式激活方案，通过逐步增加激活激光的功率，提高了荧光分子的检测效率。
2. 组织样本的制备与成像
研究团队使用小鼠脑组织切片作为实验样本，厚度在50至300微米之间。他们选择了皮层和海马体作为成像区域，并使用共聚焦显微镜进行预扫描，以确定感兴趣的区域。随后，他们使用MINFLUX显微镜对这些区域进行纳米级分辨率的成像。
3. MINFLUX成像性能
研究团队首先在较浅的组织深度（0至80微米）下对Caveolin-1蛋白进行了成像，结果显示，即使在80微米的深度下，MINFLUX仍能实现小于5纳米的定位精度。随着深度的增加，信号背景比（SBR）逐渐降低，但即使在较深的组织中，MINFLUX仍能保持较高的定位精度。
接下来，研究团队对突触后蛋白PSD95和肌动蛋白（actin）进行了成像。结果显示，MINFLUX能够在较深的组织中清晰地分辨出这些蛋白的分布，定位精度在10纳米以内。此外，研究团队还展示了双色MINFLUX成像，能够同时观察PSD95和肌动蛋白的分布，进一步揭示了突触结构的纳米级细节。
4. 活体组织成像
为了探索MINFLUX在活体组织中的成像潜力，研究团队对急性脑组织切片进行了成像。结果显示，MINFLUX在活体组织中的成像性能与固定组织相似，定位精度略低，但仍保持在纳米级范围内。这表明MINFLUX技术有望在未来用于活体组织的纳米级分辨率成像。
5. 三维MINFLUX成像
研究团队还开发了一种新的三维MINFLUX成像方案，能够在复杂组织环境中实现纳米级的三维定位。他们使用了一种结合了常规聚焦和环形光束的成像模式，能够在较深的组织中实现较高的定位精度。通过这种技术，研究团队成功地对突触后蛋白PSD95和AMPA受体进行了三维成像，揭示了这些蛋白在突触中的空间分布。
结论与意义
本文的研究表明，MINFLUX纳米显微镜能够在较厚的生物组织中实现纳米级分辨率的成像，特别是在脑组织切片中，定位精度可达到10纳米以内。这一技术突破了传统荧光显微镜在组织成像中的分辨率限制，为研究生理相关环境中的蛋白质分布提供了新的工具。
MINFLUX技术的应用不仅限于固定组织，其在活体组织中的成像潜力也为未来的神经科学研究开辟了新的方向。通过纳米级分辨率的成像，研究人员能够更深入地理解突触结构和功能的分子机制，特别是在学习和记忆等神经过程中蛋白质的动态变化。
研究亮点
- 纳米级分辨率：MINFLUX技术在较厚的生物组织中实现了小于10纳米的定位精度，突破了传统荧光显微镜的分辨率限制。
- 深度成像：研究团队在80微米的组织深度下仍能保持较高的成像性能，为深层组织的纳米级分辨率成像提供了可能。
- 双色与三维成像：MINFLUX技术能够同时观察多种蛋白质的分布，并实现纳米级的三维定位，为研究复杂的生物结构提供了新的视角。
- 活体组织成像：研究团队展示了MINFLUX在活体组织中的成像潜力，为未来的神经科学研究提供了新的工具。
未来展望
随着MINFLUX技术的进一步发展，研究人员有望在更复杂的生物组织中进行纳米级分辨率的成像，特别是在活体组织中观察蛋白质的动态变化。此外，结合自动化的成像方案，MINFLUX技术有望在神经科学、细胞生物学等领域发挥更大的作用，帮助研究人员更深入地理解生物分子的分布与功能。
本文的研究为纳米级分辨率的生物组织成像提供了新的技术手段，具有重要的科学价值和应用前景。