急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的白血病类型。尽管大多数AML患者在接受标准化疗后能够达到完全缓解，但难治性和复发性疾病仍然是一个严峻的问题。过去十年中，免疫疗法在癌症治疗中得到了广泛应用，尤其是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在治疗血液系统恶性肿瘤，特别是B细胞恶性肿瘤方面取得了显著成功。然而，CAR-T细胞疗法在AML中的应用效果相对有限，其中一个主要限制因素是CAR-T细胞的耗竭（exhaustion）。CAR-T细胞耗竭被认为是影响其疗效的主要因素之一，如何减轻耗竭、维持CAR-T细胞的效应功能和持久性，从而实现持久的临床疗效，是当前的核心挑战。

T细胞在体内发挥保护作用，负责清除识别的抗原。然而，在某些情况下，T细胞的功能可能会受到耗竭的抑制。T细胞耗竭可能由多种因素引起，包括持续暴露于抗原、T细胞周围的微环境以及免疫抑制细胞的存在。耗竭的T细胞表现出抑制性受体（如PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA4）表达增加、代谢失调、功能受损以及关键转录因子基因的改变。CAR-T细胞耗竭也被认为是由持续的肿瘤抗原刺激和免疫抑制性肿瘤微环境驱动的，导致转录和表观遗传变化。CAR-T细胞耗竭不仅影响其功能，还与患者的预后相关。

T细胞耗竭是一个多阶段、渐进的过程，具有显著的异质性。不同阶段的耗竭T细胞表现出不同的表观遗传和转录特征。研究表明，耗竭的T细胞可以分为几个不同的阶段：祖细胞耗竭、中间耗竭、终末耗竭和增殖性耗竭。祖细胞耗竭的T细胞具有较高的幼稚和记忆T细胞特征基因表达水平，易于重新编程，并且在PD-1/PD-L1阻断后仍能继续增殖。相比之下，终末耗竭的T细胞表现出较高的抑制性受体表达水平，无法重新编程，并且在PD-1/PD-L1阻断后失去增殖能力。

BET蛋白家族（包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）在维持细胞稳态中起重要作用。其中，BRD4是研究最广泛的成员。越来越多的研究表明，BET蛋白功能失调，特别是BRD4，会导致基因突变和细胞异常增殖，进而导致恶性肿瘤的发生。近年来，针对BET蛋白的抗肿瘤药物在临床前研究和临床试验中显示出显著的效果。JQ1是第一代合成的BET抑制剂，在血液系统恶性肿瘤的早期临床试验中显示出显著的抗肿瘤活性。除了直接抑制肿瘤细胞外，最近的研究发现，BET抑制剂还可以通过改善抗肿瘤免疫反应来抑制恶性肿瘤的进展。JQ1可以通过直接抑制BATF（一种与CD8+ T细胞效应记忆细胞表型分化相关的调控因子）来维持中央记忆T细胞（TCM）的特性，并增强CD8+ T细胞的功能持久性。

论文来源

本论文由Songnan Sui、Mengjun Zhong等作者共同撰写，发表于2024年的《Biomarker Research》期刊。作者来自暨南大学第一附属医院、暨南大学医学院血液学研究所等机构。论文通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，探讨了BRD4抑制剂JQ1如何减少CAR-T细胞耗竭的机制。

研究流程

1. CAR-T细胞耗竭模型的构建：
   研究人员首先构建了CAR-T细胞耗竭模型。具体步骤是将CD123 CAR-T细胞与高表达CD123的MV411细胞共培养72小时，随后通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面抑制性受体（如PD-1、TIM-3和LAG3）的表达，确认CAR-T细胞进入耗竭状态。耗竭的CAR-T细胞随后分为两组，分别用DMSO（对照组）和0.2 µM JQ1处理72小时。处理后的CAR-T细胞通过流式细胞术分选，并进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）。

2. 单细胞RNA测序和T细胞受体测序：
   scRNA-seq和scTCR-seq文库使用10x Genomics Chromium单细胞5’试剂盒构建，测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行。测序数据通过CellRanger v6.1.2管道映射到人类GRCh38参考基因组，生成细胞-基因表达矩阵。随后使用Seurat v4.3.0进行质量控制、过滤和聚类分析。

3. 数据分析：
   研究人员使用Seurat v4.3.0对scRNA-seq数据进行归一化、降维和聚类分析。通过Harmony v0.1.1包消除批次效应并合并样本。耗竭和增殖评分基于scRNA-seq数据使用Seurat v4.3.0包中的AddModuleScore函数计算。基因集功能富集分析使用ClusterProfiler v4.2.2包进行，包括GO和KEGG富集分析。基因调控网络分析使用pySCENIC v0.12.1进行，构建了基因调控网络（GRN）并评估了每个调控子的活性。

主要结果

1. JQ1减少CAR-T细胞耗竭：
   与对照组相比，JQ1处理的CAR-T细胞中耗竭的CD8+ CAR-T细胞比例和耗竭评分显著降低。此外，JQ1处理导致幼稚、记忆和祖细胞耗竭的CD8+ CAR-T细胞比例增加，而终末耗竭的CD8+ CAR-T细胞比例减少。JQ1处理还增强了CAR-T细胞的增殖、分化和激活能力。

2. JQ1增强幼稚和记忆CD8+ CAR-T细胞的功能：
   JQ1处理的幼稚和记忆CD8+ CAR-T细胞中，与T细胞增殖、激活和分化相关的基因表达显著上调。转录调控网络分析显示，JQ1处理的幼稚CD8+ CAR-T细胞中，EGR1和BCLAF1等转录因子的活性增加，而POU2F2和ZBTB38等转录因子的活性降低。

3. JQ1维持早期耗竭的CD8+ CAR-T细胞状态：
   JQ1处理增加了祖细胞耗竭的CD8+ CAR-T细胞比例，并阻止了其向终末耗竭状态的转化。功能富集分析显示，JQ1处理的祖细胞耗竭CD8+ CAR-T细胞中，与T细胞分化、激活和增殖相关的基因表达上调。

4. JQ1通过调节BATF和EGR1减少CAR-T细胞耗竭：
   在JQ1处理的幼稚、记忆和祖细胞耗竭的CD8+ CAR-T细胞中，BATF的活性和表达下调，而EGR1的活性和表达上调。这些转录因子的调控基因与T细胞增殖、激活和分化相关。

结论

本研究表明，BRD4抑制剂JQ1可以通过下调BATF的活性和表达、上调EGR1的活性和表达，减少CAR-T细胞耗竭并阻止其终末分化。这为改善CAR-T细胞疗法的有效性提供了一种新的策略。

研究亮点

1. 重要发现：JQ1通过调节BATF和EGR1的活性，显著减少了CAR-T细胞的耗竭，并增强了其功能。
2. 方法创新：研究首次使用单细胞RNA测序技术，详细解析了JQ1对CAR-T细胞耗竭的调控机制。
3. 应用价值：该研究为CAR-T细胞疗法在AML等血液系统恶性肿瘤中的应用提供了新的思路，具有重要的临床意义。

其他有价值的信息

研究还发现，AML患者中EGR1及其靶基因的高表达与较好的预后相关，而BATF及其靶基因的低表达也与较好的预后相关。这些发现进一步支持了JQ1通过调节BATF和EGR1来改善CAR-T细胞功能的机制。