增强基因递送至乳腺癌的高效siRNA装载和pH响应性小细胞外囊泡

学术背景

近年来，小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）因其天然来源和固有的归巢特性，成为药物递送领域的热门研究对象。sEVs是由大多数真核细胞分泌的脂质纳米颗粒，直径通常在50-150纳米之间。它们携带多种生物分子，能够通过细胞间通讯传递信息，并在体内表现出良好的结构和生理稳定性。这些特性使得sEVs在治疗多种疾病方面具有巨大潜力，尤其是在药物递送领域。

然而，尽管sEVs在药物递送方面展现了广阔的前景，但其临床应用仍面临诸多挑战。首先，sEVs的大规模生产和高效纯化技术尚未成熟，限制了其在临床中的广泛应用。其次，sEVs的异质性导致其在体内的效果难以预测。此外，传统的药物装载方法效率低下，且难以实现精准的细胞靶向递送。特别是对于较大的生物分子（如RNA），sEVs的装载效率尤为不足。这些问题严重阻碍了sEVs在基因治疗中的应用。

为了解决这些问题，研究人员开发了一种新型的基因递送系统，通过整合手性石墨烯量子点（chiral graphene quantum dots, GQDs）和pH响应性肽，显著提高了sEVs的siRNA装载效率和靶向递送能力。这一研究不仅为sEVs在基因治疗中的应用提供了新的思路，还为克服乳腺癌化疗耐药性提供了潜在的解决方案。

论文来源

这篇论文由Gaeun Kim、Runyao Zhu、Sihan Yu、Bowen Fan、Hyunsu Jeon、Jennifer Leon、Matthew J. Webber和Yichun Wang共同完成，研究团队来自University of Notre Dame的化学与生物分子工程系。论文于2024年12月23日发表在ACS Biomaterials Science & Engineering期刊上，题为《Enhancing Gene Delivery to Breast Cancer with Highly Efficient siRNA Loading and pH-Responsive Small Extracellular Vesicles》。

研究流程与结果

1. sEVs的分离与表征

研究首先从人乳腺癌细胞MCF-7中分离出sEVs，并对其进行了详细的表征。通过透射电子显微镜（TEM）观察，确认了sEVs的球形结构和完整性。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，sEVs的粒径分布为127.9 ± 47.0纳米，表面电荷为-12.93 ± 0.85毫伏，表明其具有良好的胶体稳定性。此外，通过Western blot分析，研究人员确认了sEVs的标志物（CD9、CD63、CD81和HSP70）的存在，进一步验证了sEVs的纯度。

2. 手性石墨烯量子点（GQDs）的合成与表征

为了增强sEVs的siRNA装载能力，研究人员开发了一种手性石墨烯量子点（GQDs）。通过改良的Hummers方法，研究人员合成了GQDs，并通过D-半胱氨酸对其进行手性功能化。TEM分析显示，GQDs的平均粒径为6.88 ± 2.16纳米。圆二色光谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析进一步证实了GQDs的手性功能化。这些手性GQDs能够通过纳米级的手性相互作用，高效地将siRNA装载到sEVs中，同时保持sEVs的结构完整性。

3. pH响应性肽（GALA）的功能化

为了增强sEVs的溶酶体逃逸能力，研究人员设计了一种pH响应性肽（GALA），并通过胆固醇将其锚定在sEVs的脂质双层上。GALA肽在酸性条件下会发生构象变化，从无规卷曲转变为α-螺旋结构，从而促进sEVs与溶酶体膜的融合，实现siRNA的胞质释放。通过荧光标记实验，研究人员证实了GALA肽成功插入sEVs膜，并在酸性条件下表现出显著的电荷变化。

4. siRNA的装载与递送

研究人员利用手性GQDs将siRNA装载到sEVs中，并通过GALA肽的功能化实现了高效的溶酶体逃逸。实验结果显示，手性GQDs装载方法的siRNA渗透效率为63.46 ± 4.07%，是传统超声装载方法的8.82倍。此外，装载了siRNA的sEVs在血清中表现出良好的稳定性，能够在6小时内保持siRNA的完整性。

5. 细胞摄取与溶酶体逃逸

通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，研究人员发现，GALA功能化的sEVs在乳腺癌细胞中表现出显著的胞质递送能力。与未功能化的sEVs相比，GALA-sEVs的胞质递送效率提高了1.74倍。此外，GALA-sEVs在酸性条件下能够有效逃逸溶酶体，释放siRNA到细胞质中，从而实现高效的基因沉默。

6. TGF-β基因沉默与化疗增敏

研究人员利用装载了siRNA的sEVs成功沉默了乳腺癌细胞中的TGF-β基因，显著降低了细胞外基质（ECM）的硬度，从而增强了乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素（Doxorubicin, Dox）的敏感性。实验结果显示，TGF-β基因沉默后，乳腺癌细胞的迁移能力显著降低，且与Dox联合治疗时表现出显著的协同效应。

结论与意义

这项研究开发了一种高效的sEVs基因递送平台，通过整合手性GQDs和pH响应性肽，显著提高了siRNA的装载效率和靶向递送能力。这一平台不仅保留了sEVs的天然生物学优势，还通过增强的溶酶体逃逸能力实现了高效的基因沉默。研究结果表明，这一系统在克服乳腺癌化疗耐药性方面具有巨大的潜力，为未来的癌症治疗提供了新的思路。

研究亮点

1. 高效siRNA装载：通过手性GQDs实现了sEVs的高效siRNA装载，装载效率是传统方法的8.82倍。
2. pH响应性溶酶体逃逸：GALA肽的功能化显著增强了sEVs的溶酶体逃逸能力，提高了siRNA的胞质递送效率。
3. 协同化疗增敏：TGF-β基因沉默显著降低了乳腺癌细胞的ECM硬度，增强了Dox的化疗效果。

这项研究不仅为sEVs在基因治疗中的应用提供了新的技术手段，还为克服乳腺癌化疗耐药性提供了潜在的解决方案，具有重要的科学和应用价值。