通过新建立的筛选方法鉴定纳米霉素A及其类似物作为牙龈卟啉单胞菌IX型分泌系统的功能抑制剂
新型筛选方法鉴定Nanaomycin A及其类似物作为Porphyromonas gingivalis IX型分泌系统的功能抑制剂
学术背景
Porphyromas gingivalis（牙龈卟啉单胞菌）是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是慢性牙周炎的主要病原体之一。除了牙周疾病，P. gingivalis还与多种系统性疾病如糖尿病、类风湿性关节炎、痴呆和早产等密切相关。因此，降低P. gingivalis的毒力是治疗这些疾病的关键策略之一。
P. gingivalis通过其IX型分泌系统（Type IX Secretion System, T9SS）分泌一系列高度水解的蛋白酶，称为gingipains。这些蛋白酶能够从环境中获取肽类作为能量来源。尽管T9SS相关蛋白已被广泛研究，但目前尚未发现针对T9SS的特异性抑制剂。因此，开发一种能够筛选T9SS抑制剂的方法对于研究T9SS的功能机制以及开发治疗牙周疾病的新药物具有重要意义。
论文来源
本论文由Yuko Sasaki、Takehiro Matsuo、Yoshihiro Watanabe、Masato Iwatsuki、Yuki Inahashi、Satoshi Nishida、Mariko Naito和Mikio Shoji共同撰写。研究团队来自Nagasaki University、Kitasato University和Teikyo University。论文于2024年11月22日在线发表在The Journal of Antibiotics期刊上，DOI为10.1038/s41429-024-00790-8。
研究流程与结果
1. 研究背景与目标
本研究的目标是开发一种新的筛选方法，用于鉴定T9SS的功能抑制剂。为此，研究团队聚焦于一种名为MC培养基（Milk Casein Medium）的最小液体培养基，该培养基以牛奶酪蛋白为唯一蛋白来源。通过观察P. gingivalis在MC培养基中的浊度变化，研究团队希望找到能够抑制T9SS功能的化合物。
2. MC培养基的特性分析
研究团队首先验证了MC培养基的特性。他们发现，P. gingivalis野生型菌株ATCC 33277在MC培养基中能够引起浊度增加，但并不伴随细菌的生长。进一步实验表明，碘乙酰胺（Iodoacetamide, IAM）和羰基氰化物3-氯苯腙（Carbonyl Cyanide 3-Chlorophenylhydrazone, CCCP）能够显著抑制MC培养基的浊度增加。IAM是一种烷基化剂，能够抑制gingipains的活性，而CCCP是一种质子载体，能够破坏T9SS所需的质子动力。
此外，研究团队还发现，gingipain缺失突变体和T9SS缺失突变体均无法引起MC培养基的浊度增加，表明MC培养基的浊度变化依赖于gingipain活性和T9SS功能。
3. T9SS抑制剂的筛选
基于MC培养基的特性，研究团队开发了一种高通量筛选方法，用于鉴定T9SS抑制剂。他们使用了一个包含603种化合物的天然化合物库（Ōmura Natural Compound Library），并通过96孔板进行筛选。筛选标准是化合物能够抑制MC培养基的浊度增加，但不影响细菌在BHI培养基中的生长。
通过筛选，研究团队鉴定出两种化合物OM-173αA和OM-173βA，它们能够显著抑制MC培养基的浊度增加，但不影响细菌在BHI培养基中的生长。进一步实验表明，这两种化合物是Nanaomycin A的类似物。
4. Nanaomycin A及其类似物的作用机制
研究团队进一步研究了Nanaomycin A及其类似物的作用机制。他们发现，这些化合物能够抑制MC培养基中casein蛋白的降解，但并不直接抑制gingipains的活性。这表明，Nanaomycin A及其类似物可能通过影响T9SS的功能来抑制gingipains的分泌。
此外，研究团队还发现，Nanaomycin A及其类似物在MC培养基中显著降低了gingipains的活性，尤其是在Rgp（精氨酸特异性蛋白酶）活性方面。这表明，这些化合物可能通过抑制T9SS的功能，阻止gingipains在MC培养基中的积累。
5. 实验验证与数据分析
为了验证这些化合物的作用机制，研究团队进行了多项实验。他们通过SDS-PAGE分析了MC培养基中casein蛋白的降解情况，发现Nanaomycin A及其类似物能够显著抑制casein蛋白的降解。此外，他们还通过酶活性测定实验，验证了这些化合物对gingipains活性的影响。
数据分析表明，Nanaomycin A及其类似物在MC培养基中的抑制作用呈剂量依赖性，其IC50值约为5 µM。这些结果进一步支持了这些化合物作为T9SS功能抑制剂的潜力。
结论与意义
本研究的结论是，MC培养基可以作为一种有效的筛选工具，用于鉴定T9SS的功能抑制剂。通过这种方法，研究团队成功鉴定了Nanaomycin A及其类似物作为潜在的T9SS抑制剂。这些化合物不仅为研究T9SS的功能机制提供了新的工具，还为开发治疗牙周疾病的新药物提供了潜在的候选分子。
研究的亮点
新型筛选方法的开发：本研究首次利用MC培养基的特性，开发了一种高通量筛选T9SS抑制剂的方法，为研究T9SS的功能机制提供了新的工具。
Nanaomycin A及其类似物的发现：研究团队成功鉴定了Nanaomycin A及其类似物作为T9SS的功能抑制剂，这些化合物具有潜在的临床应用价值。
作用机制的揭示：通过一系列实验，研究团队揭示了Nanaomycin A及其类似物通过抑制T9SS功能来阻止gingipains分泌的作用机制，为进一步研究T9SS的功能提供了新的视角。
其他有价值的信息
本研究还发现，CCCP在BHI培养基中能够抑制P. gingivalis的生长，但在MC培养基中则表现出更强的抑制作用。这表明，CCCP可能通过影响T9SS的功能来抑制细菌的生长，而不仅仅是抑制gingipains的活性。
此外，研究团队还发现，不同P. gingivalis菌株在MC培养基中的浊度变化存在差异，这可能与不同菌株中gingipains的表达水平有关。这一发现为进一步研究P. gingivalis的毒力机制提供了新的线索。
总结
本研究通过开发一种新型筛选方法，成功鉴定了Nanaomycin A及其类似物作为T9SS的功能抑制剂。这些发现不仅为研究T9SS的功能机制提供了新的工具，还为开发治疗牙周疾病的新药物提供了潜在的候选分子。未来的研究将进一步探索这些化合物的作用机制，并评估其在临床应用中的潜力。