利用大格式微阵列实现可扩展空间转录组学的新方法：Array-Seq技术的诞生

背景与研究起源

近年来，空间分子分析（spatiomolecular analyses）成为生物医学研究和临床病理学的重要工具，因为它能够研究组织中的细胞和分子空间位置如何影响其功能及其在健康和疾病中的异常变化。但现有的空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）技术在多个层面面临制约：设备昂贵、操作复杂、表面积小、不支持大批量样本处理以及与常规组织学染色（如H&E染色）不兼容。这些缺点限制了技术的普及，也增大了其用于基础研究和临床分析的成本和难度。

早期的空间转录组学技术（如Visium平台）通过将空间条形码（spatial barcode）连接到捕获poly-A尾的寡聚核苷酸探针上实现了特定组织区域的转录组测序。然而，这种方法的表面积小和高成本成为广泛应用的主要障碍。与此同时，由于经典的寡核苷酸微阵列（oligonucleotide microarrays）作为一种成熟的高通量基因表达分析工具，曾在二十世纪初风靡一时，因此研究人员推测，能否重新利用这些经典的工具开发更高效、低成本的空间转录组学平台？正是在这一背景下，本文的研究团队提出了一种创新性解决方案——Array-Seq方法。

论文来源与研究团队

这篇论文名为《Repurposing large-format microarrays for scalable spatial transcriptomics》，由Denis Cipurko、Tatsuki Ueda、Linghan Mei和Nicolas Chevrier完成。研究工作主要在美国芝加哥大学普利兹克分子工程学院（Pritzker School of Molecular Engineering, University of Chicago）完成。论文于2024年11月发表于Nature Methods杂志，在线DOI为：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02501-5。

实验设计与研究流程

在本文中，研究团队提出了Array-Seq技术，将经典寡核苷酸微阵列改造成可用于空间转录组学研究的高通量平台。其研究过程可分为以下几个关键步骤：

1. 通过微阵列构建空间条形码捕获探针

研究人员设计了定制的寡核苷酸微阵列，每个阵列点上携带唯一的条形码序列（spatial barcode）和两个共同的锚定序列（anchors），满足空间定位和后续操作的要求。这些条形码探针通过喷墨式磷酰胺化学（ink-jet phosphoramidite chemistry）在玻片表面合成，每片微阵列上包含974,016个点，每个点直径仅为30µm，中心点之间的间距为36.65µm，总表面积达11.31 cm²。

随后，通过两步反应在微阵列上装配mRNA捕获探针：第一步中，寡聚序列通过互补配对与阵列上的锚定序列杂交；第二步，使用DNA聚合酶（如Phusion DNA聚合酶）进行引物延伸反应，并通过DNA连接酶（T4 DNA连接酶）连接生成完整的捕获探针。最后，未正确连接的探针通过清洗被去除，确保捕获探针的纯度达75%以上。

2. 样本处理与空间转录组分析

研究人员使用Array-Seq平台分析了小鼠和人类组织样本的二维和三维空间转录组学数据。组织切片先经过固定（使用甲醇预冷固定），然后完成标准的H&E（苏木精-伊红）染色以验证组织学特征。通过组织中mRNA的空间捕获和反转录合成cDNA，完成了空间条形码、序列独特分子标识符（Unique Molecular Identifier, UMI）和目标序列的关联。

随后，通过定量高通量测序（Illumina平台）和算法分析（如STARsolo和Scanpy工具包），生成对应的空间基因表达矩阵，用于后续的细胞分型、组织区域划分和空间基因表达分析。

3. 结果验证和比较

通过实际数据，研究验证了Array-Seq技术的性能，并与现有的Visium平台进行了全面比较。实验涉及小鼠嗅球组织（main olfactory bulb, MOB）、肾脏、骨髓等多个样本。实验发现：

1. 高敏感性和分辨率：在小鼠嗅球中，Array-Seq每个点检测到的UMI数量平均为3582个，检测到的基因数量为1971个。其数据精确复现了组织层次的已知特征。
2. 样本覆盖灵活性：Array-Seq每张载玻片能捕获约200万到2000万个细胞，依据组织样本的类型和切片数量而定。
3. 三维分析能力：实验利用连续切片构建了小鼠肾脏肾区域的三维转录组分区，捕捉了组织随深度变化的空间特征。
4. 跨平台比较：与Visium相比，Array-Seq平台点密度高8.1倍，总点数增加216.8倍，表面积是其26.7倍，且在检测灵敏度和特定标志基因的空间定位上表现相当优秀。

4. 实验扩展和全器官应用

研究进一步扩展了Array-Seq对于多组织样本和整个人体器官的应用。在分析人类脾脏的实验中，一整片长约12 cm²的组织切片覆盖了750,640个点，检测到了功能区域（如白髓、红髓）的已知基因表达模式和细胞类型分布。特别是免疫细胞生成的化学趋化因子（例如CXCL13和对应受体CXCR5）显示出高度特异的空间分布，与预期结果一致。

研究结论与意义

Array-Seq平台结合了经典微阵列和下一代测序的优点，创造性地解决了当前空间转录组学方法中存在的高成本、低通量和复杂性等难题。该方法主要具有以下优点：

1. 高效可扩展：Array-Seq支持大表面积样本，同时减少单次实验的成本至Visium的二十分之一以下（每平方厘米约314-628美元）。
2. 简单易用：无需复杂的专用设备，实验流程与标准显微镜切片制备和H&E染色兼容。
3. 科学与应用价值：提供高分辨率的数据以解析复杂组织结构，为基础和临床研究（如疾病空间异质性的研究）打开新方向。
4. 突破性技术结合：通过重用微阵列技术，全面开发空间转录组学的潜力，使更多实验室能够负担得起这一研究工具。

研究亮点与未来展望

这项研究最重要的亮点包括： - 创新型的技术设计，将传统设备高效转化为前沿研究工具； - 大表面积、多样化样本分析的能力，以及在三维样本研究中的突出表现； - 在检测灵敏度与分辨率达到商业化平台水平时，极大地降低了成本，为大规模公共研究项目的开展提供了可能性。

尽管Array-Seq当前在分辨率（30µm点直径）和固定样本组织（如石蜡包埋样本）兼容性上尚需改进，但研究团队计划通过进一步技术优化（例如优化点间距设计和扩展样本预处理能力）克服这些挑战，以继续推动空间组学领域的技术革新。在未来，该平台可能通过结合多模态分析技术（如蛋白组学联合分析）和自动化工艺，进一步扩展其适用范围。

Array-Seq技术不仅为基础生物学研究提供了全新工具，也为精准医学和空间病理学领域提供了重要的技术支撑。