CRISPR依赖性筛选在原代造血干细胞中鉴定出KDM3B是IDH2和TET2突变基因型的特异性易感性

CRISPR依赖筛选在原代造血干细胞中识别出KDM3B作为IDH2和TET2突变基因型的特异性易感性

背景和研究意义

克隆性造血(Clonal Hematopoiesis, CH)是指由特定突变的造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell, HSC)引发的基因上不同的亚群细胞的异常生长。这种现象在60岁以上的人群中十分普遍,影响了超过20%的人口。CH与急性髓系白血病(AML)的恶性转化风险增加有关,并且还与更高的全因死亡率和各种与年龄相关的疾病(如心血管疾病)相关联。尽管之前的基因研究已经识别出与CH相关的基因突变,但迄今为止在CH中识别治疗靶点的工作还存在挑战。这主要是因为缺乏适用于研究初级造血干细胞(HSPC)的体外平台。在这一研究中,作者利用HSPC和骨髓内皮细胞(Bone Marrow Endothelial Cells, BMECs)的共培养系统,进行CRISPR/Cas9筛选,识别出组蛋白去甲基化酶KDM3B在IDH2和TET2突变HSPC中的关键角色。

论文来源

这篇研究由Michael R. Waarts等研究者共同撰写,作者分别来自Memorial Sloan Kettering Cancer Center、Dana-Farber Cancer Institute、Icahn School of Medicine at Mount Sinai、Cincinnati Children’s Hospital Medical Center等机构。本研究发表在Cancer Discovery期刊上。

研究方法详述

实验流程

  1. 平台建立:首先,研究者建立了HSPC与BMEC的共培养系统。在这种系统中,通过在BMEC上长时间维持和扩增HSPC,研究者得以保留HSPC的移植能力并能产生全谱系的髓系细胞。
  2. 动物模型和遗传背景:使用先前报道的基因型模型,包括dnmt3aflox/flox、asxl1flox/flox、tet2flox/flox和idh2r140qflox/+小鼠。他们将这些小鼠与HSC特异性Cre重组酶和荧光报告基因(tdT+)进行交叉。
  3. 竞争性培养实验:通过竞争性共培养实验,研究者在不同的血液生成细胞系中评估了野生型与突变型HSPC的表现。
  4. 体外和体内验证:对突变HSPC进行体外CRISPR/Cas9基因编辑和小分子药物干预,并通过移植实验在体内验证发现的基因依赖性。
  5. CRISPR筛选:利用针对表观遗传修饰酶的CRISPR库进行大规模筛选,识别在不同基因突变型HSPC中的依赖性基因。

实验细节

科研人员通过使用一套由997个单引导RNA(single guide RNA, sgRNA)组成的CRISPR库,针对191个基因进行了筛选。通过遗传操作,确定适宜的感染条件并维持细胞活力和扩增能力。筛选过程包括感染HSPC并将其与BMEC共培养,之后进行DNA序列测序以评估sgRNA的代表性。

接下来,他们对dnmt3a-/-、asxl1-/-、tet2-/-和idh2r140q型HSPC进行了CRISPR筛选,并通过评分系统评估野生型与突变型HSPC之间的基因依赖差异。在这些基因中,KDM3B在IDH2r140q和TET2-/-细胞中表现出显著的依赖性,经过体内的进一步验证,都显示出相似的基因依赖性结果。

结果详述

  1. KDM3B在体外和体内的依赖性:KDM3B的损失显著减少了IDH2r140q和TET2-/-细胞的竞争力,实验表明KDM3B是这些突变HSPC中的特异性依赖基因。体内实验进一步表明KDM3B的丧失大幅度削弱了突变细胞的生存能力和自我更新能力。
  2. 人类CH突变细胞内的依赖性:在人类CH突变细胞中,KDM3B的丧失也显示出类似的依赖性,特别是在TET2突变的HSPC中。研究者通过一系列的竞争性培养和克隆形成实验验证了这些结果。
  3. 机制研究:研究表明IDH2突变导致的2-HG产物是KDM3B依赖性的关键因素,且KDM3B酶活性对突变细胞的生存至关重要。KDM3B和突变的IDH2在表观遗传层面上协同调控了一些关键基因,包括细胞因子受体基因,进一步加强了这些基因在突变细胞中的转录输出。

结论及研究价值

本研究的重要发现之一是识别出KDM3B这一组蛋白去甲基化酶在IDH2和TET2突变的HSPC中的特异性依赖性。研究指出,KDM3B的酶活性对于IDH2突变细胞的生存至关重要,指出了潜在的治疗靶点。此外,研究还发现了细胞因子受体信号在IDH2突变细胞中的下调,这为存在这些突变的CH和AML患者提供了新的治疗思路。

研究亮点

  1. 突变特异性基因依赖性:识别出KDM3B在特定突变型HSPC中发挥重要作用,为靶向治疗提供了新方向。
  2. 表观遗传调控的机制探讨:揭示了KDM3B和IDH2突变在表观遗传层面上的协同作用,使得对这些机制的理解更为深入。
  3. 体外平台的开发与应用:研究开发了一种有效的体外平台,能够快速、准确地筛选出相关基因依赖性,这为未来的研究提供了一个有力的工具。