Clemizole对由α-突触核蛋白形成纤维诱导的帕金森病病理学的影响

背景介绍

帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是典型的神经退行性疾病，主要与线粒体功能障碍和氧化应激相关。然而，目前针对这些病理事件的治疗手段尚未成功地从实验室转化至临床应用。造成这种转化失败的重要原因之一是使用了无法真实再现疾病病理学和进程的传统模型。因此，为了解决这一问题，本研究采用了更具生理相关性的模型，通过暴露α-突触核蛋白预形成纤维（Pre-Formed Fibrils，PFF）于SH-SY5Y细胞和Sprague Dawley大鼠，以探索过渡受体电位通道5（Transient Receptor Potential Canonical 5，TRPC5）在PD样病理中的作用及其通过缓解氧化应激和改善线粒体健康的潜在治疗效果。

论文来源

这篇研究论文由Bhupesh Vaidya, Pankaj Gupta, Soumojit Biswas, Joydev K. Laha, Ipsita Roy, Shyam Sunder Sharma等人在印度国家药物教育与研究所进行，于2024年发表在《Neuromolecular Medicine》期刊上。

研究流程与方法

研究对象

研究对象包括SH-SY5Y细胞和Sprague Dawley大鼠。研究主要采用体内和体外模型，通过注射和细胞处理的方法来建立PD样病理。

α-突触核蛋白的纯化和合成

研究首先利用表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞来获得重组人α-突触核蛋白。通过一系列纯化步骤，包括离子交换色谱法，最后制备出纯化的α-突触核蛋白单体，然后利用这些单体在缓冲液中合成PFF，并通过硫磺素T（Thioflavin T，THT）荧光检测和透射电子显微镜等方法进行质量验证。

体内实验设计

将α-突触核蛋白PFF注射到Sprague Dawley大鼠的纹状体特定位置，以诱导PD样病理。大鼠分为多组，分别接受不同剂量的Clemizole治疗（10 mg/kg和30 mg/kg）14天。大鼠随后被解剖，各种分子和生化参数被测量。

行为测试

进行Rotarod测试、Y迷宫自发交替测试和被动回避测试来评估大鼠的运动协调能力、工作记忆和恐惧条件反应。这些测试的数据用于比较不同处理组之间的差异。

生化和分子分析

通过免疫印迹法、实时定量PCR、钙蛋白活性测定等方法来检测纹状体和中脑样品中的α-突触核蛋白、p-α-突触核蛋白、TRPC5、TH、PGC-1α、TFAM等蛋白和基因的表达。同时，还测量了线粒体复合物I的活性和ND2基因表达水平。

细胞培养与体外实验

SH-SY5Y细胞被处理于α-突触核蛋白PFF以及Clemizole或TRPC5 siRNA，进行细胞活力测试、氧化应激分析、线粒体功能检测、免疫细胞化学染色等。

数据分析

所有实验数据利用GraphPad Prism 8软件进行分析，采用单因素ANOVA分析及Tukey测试，以p < 0.05作为统计显著性水平。

主要发现

α-突触核蛋白表达减少

Clemizole在中脑和纹状体中均显著减少了α-突触核蛋白和p-α-突触核蛋白的表达，从而缓解了PFF处理的大鼠的神经行为异常。这一结果同样适用于细胞实验中，Clemizole表现出剂量依赖性的效果。

TRPC5表达减少

PFF处理的大鼠以及细胞模型中，TRPC5的表达显著增加，而Clemizole能够有效减少这种表达，暗示了TRPC5在PD病理中的潜在作用。

行为改善

在PFF处理的大鼠中，Clemizole显著改善了其在行为测试中的表现，恢复了运动协调和记忆能力，同时提高了TH的表达水平。

线粒体功能改善

Clemizole能够显著提高线粒体生物合成相关基因PGC-1α和TFAM的表达，增加线粒体复合物I的活性和ND2基因水平，从而改善了整体线粒体健康状态。

氧化应激和钙信号通路

Clemizole显著降低了PFF处理的SH-SY5Y细胞中的总ROS和线粒体ROS水平，恢复了细胞膜电位。此外，钙信号通路的相关基因Calmodulin和Parvalbumin的表达变化也得到了恢复。

结论与意义

这项研究首次采用人α-突触核蛋白PFF模型系统筛选药理制剂，对PD病理具有重要的理论和应用价值。结果表明，Clemizole通过抑制TRPC5通道，显著改善了由α-突触核蛋白PFF引发的PD样病理，包括氧化应激水平、线粒体功能以及行为异常。这为开发新的PD治疗药物提供了潜在的靶点和方法，并为其他神经退行性疾病的研究提供了新的思路。

研究亮点

这项研究的亮点在于首次将人α-突触核蛋白PFF模型系统用于药物筛选，展示了Clemizole对PD病理的多重改善作用，特别是在TRPC5通道调节、线粒体功能恢复和氧化应激减轻方面的显著疗效。

上述研究为未来进一步探索TRPC5通道在其他神经退行性疾病中的潜在益处奠定了基础，同时也为新型药物开发提供了有力的支持。