反義オリゴヌクレオチドがSLC20A2の発現を増強し、ヒト化マウスモデルでの脳石灰化を抑制

背景と研究課題

原発性家族性脳石灰化（Primary Familial Brain Calcification、PFBC）は、加齢に関連した神経遺伝性疾患で、基底神経節、視床、小脳などの脳部位で両側性の石灰化沈着を特徴とします。PFBC患者は、頭痛、パーキンソン様運動障害、認知機能低下、不安、うつなど多様な症状を呈します。現在、PFBCの臨床管理は対症療法に依存しており、脳石灰化の進行を効果的に抑制する治療法は存在しません。

PFBCの遺伝的基盤には、SLC20A2、PDGFRB、PDGFBなどの遺伝子の変異が含まれ、約61%のPFBC症例はSLC20A2遺伝子のヘテロ接合性変異に起因しています。しかし、SLC20A2の変異がどのように脳石灰化を引き起こすか、その病理メカニズムは完全には解明されていません。本稿の著者チームは、SLC20A2遺伝子の新しい深部イントロン変異を発見し、反義オリゴヌクレオチド（Antisense Oligonucleotides、ASOs）によるmRNAスプライシングの制御を通じて遺伝子発現を回復させる可能性を探りました。

出典と著者

この研究は、赵淼らによって完成され、主な著者は福建医科大学、上海脳科学と類脳技術センター、中国科学院神経科学研究所などの複数の機関に所属しています。研究結果は2024年10月9日に《Neuron》に掲載されました。

研究設計とプロセス

サンプルと遺伝学分析

研究チームは、外顕子シーケンシングで異常結果が得られなかった135人のPFBC患者から、全ゲノムシーケンシング（Whole Genome Sequencing、WGS）を通じて6家系の5種類のSLC20A2遺伝子深部イントロン変異を発見しました。これらの変異はSangerシーケンシングで検証され、計算予測分析によりmRNAのスプライシング部位に影響を与える可能性が示されました。

分子メカニズム研究

ミニ遺伝子（minigene）スプライシングモデルを利用して、これらのイントロン変異がどのように異常スプライシングを引き起こすかが探られました。結果は、変異が新型の隠れ外顕子（Cryptic Exons）を導入し、これらの隠れ外顕子がmRNAスプライシングに影響を与えて非機能性mRNAの生成を増加させ、SLC20A2タンパク質の発現不足を引き起こすことを示しました。

さらに、RNAプルダウン（RNA Pull-down）と質量分析により、特定のRNA結合タンパク質（例：SRSF3とhnRNPQ）の隠れ外顕子への結合能力の変化が確認され、変異がスプライシング制御メカニズムをどのように妨げるかがさらに説明されました。

細胞実験とASO介入

研究チームは隠れ外顕子を標的とするASOsを設計し、RNAとの安定な結合を介してスプライシング体の関連部位への結合を妨げ、異常スプライシングを抑制しました。細胞実験の結果、ASOsは隠れ外顕子による異常mRNA生成を著しく減少させ、SLC20A2タンパク質の発現レベルを回復させました。この結果は、PFBC患者由来の線維芽細胞で検証されました。

ヒト化マウスモデルの検証

研究者は人間のSLC20A2変異イントロン配列を持つヒト化ノックイン（Knock-in）マウスモデルを作成し、PFBC患者の脳石灰化の病理プロセスをシミュレートしました。野生型マウスと比較して、ノックインマウスは脳脊髄液中の無機リン（Pi）レベルの上昇と進行性の脳石灰化沈着を示しました。

ASOsを脳室内（Intracerebroventricular、ICV）に注射することで、研究者は脳脊髄液中のPiレベルを低下させ、ノックインマウスの脳石灰化の進行を顕著に抑制し、ASO治療の有効性を検証しました。

主な発見と結果

1. 遺伝的発見：5種の深部イントロン変異がSLC20A2遺伝子の隠れ外顕子を介した異常スプライシングを引き起こし、タンパク質の発現を減少させることが初めて明らかになった。
2. 細胞レベルの検証：ASOsは隠れ外顕子のスプライシングを抑制することで、患者由来細胞におけるSLC20A2蛋白の発現を効果的に回復させた。
3. マウスモデルの検証：ヒト化マウスにおいて、ASOの注射は脳脊髄液中のPiレベルを低下させ、脳石灰化の進行を緩和させた。
4. 治療の可能性：ASOを介したスプライシング修飾技術は、SLC20A2不足が原因のPFBCを解決するための実行可能な治療戦略を提供する。

研究の意義と価値

科学的価値

本研究は、深部イントロン変異が隠れ外顕子を介して遺伝子機能喪失を引き起こす分子メカニズムを体系的に解明し、PFBCの遺伝的病因論を拡大しました。また、研究はSLC20A2遺伝子関連病に対する新しいマウスモデルを提供し、その病理メカニズムの深い探求に役立ちます。

臨床価値

ASO治療の他の遺伝性疾患（脊髄性筋萎縮症やデュシェンヌ型筋ジストロフィーなど）における成功例は、ASOを介したスプライシング制御が臨床転用の可能性を有することを示しています。本文で提示された「CRACE」戦略（Calcification Repression by ASO Corrected Expression）は、PFBCの石灰化進行を効果的に緩和するだけでなく、他のPi恒常性乱れに関連する病気（慢性腎臓病や心血管病など）に対しても治療の考え方を提供します。

ハイライトと革新

1. SLC20A2深部イントロン変異の病因メカニズムを初めて検証。
2. ASOに基づいた「CRACE」治療戦略を提案し、PFBCや他の遺伝性疾病に対する新しい方向性を提供。
3. PFBCを高効率でシミュレートするノックインマウスモデルを開発し、さらなる研究や薬剤スクリーニングを容易にした。

未来への展望と改良方向

将来の研究では、治療の領域特異性と投与効率を高めるために、ASOの分子修飾と送達方法をさらに最適化する必要があります。同時に、複数のASOを組み合わせて治療に使用することは、治療効果を高め、正確な医学の実現の基礎を築く可能性があります。

本研究の重要な発見と技術革新は、遺伝性疾患の治療における遺伝子スプライシング制御の可能性を示し、新しい治療法の開発に堅実な根拠を提供しました。