研究背景

神経科学の分野では、amyotrophic lateral sclerosis (ALS) と frontotemporal lobar degeneration (FTLD) は高度に異質な神経変性疾患の2つである。研究によれば、これらの疾患において、c9orf72遺伝子の非コード六核酸反復拡張が最も一般的な遺伝的原因である。しかし、この反復拡張が転写領域での具体的な結果としてどのような影響を及ぼすのかは未だ完全には明らかでない。既存の研究では、c9orf72反復拡張が遺伝子発現の減少、RNA焦点の形成、ならびにジペプチド反復タンパク質（DPR）の形成などのメカニズムを通じて疾患を引き起こす可能性があると示されているが、これらのメカニズムがどのようにして広範な臨床的・病理学的変異を引き起こすのかは依然として結論が出ていない。

近年、研究者はALSおよびFTLD研究における小脳の重要性に徐々に注目している。小脳はこれらの疾患において比較的影響を受けないと伝統的には考えられてきたが、最新の研究では、この脳領域におけるTDP-43タンパク質のレベルが低下しており、RNA焦点とDPRタンパク質が広範に存在することが示されている。従って、小脳組織の転写組変化の研究は、神経細胞の大量死が主に影響を受ける脳領域において隠れているかもしれない病理メカニズムを解明するのに有益である。

Mayo ClinicのEvan Udineらによって発表されたこの研究は、転写組シーケンシング技術を用いてc9orf72反復拡張患者の小脳における転写組の変化を確認および分析するものであり、ALSおよびFTLDの発病メカニズムのさらなる理解を目指している。この論文は”Acta Neuropathologica”誌に発表され、患者のサンプルをRNAシーケンシング（RNA-seq）で分析した結果を示し、多くの新しい発見と共に神経変性疾患に関連する潜在的な分子メカニズムを明らかにしている。

研究フロー

本研究の主要なフローは以下の通りである：

1. サンプル収集とRNA抽出

研究ではMayo Clinic脳バンクからの193の小脳組織サンプルを使用した。これには60のc9orf72反復拡張患者、108の非c9orf72反復拡張患者、25の神経疾患のない対照サンプルが含まれる。サンプルのRNAはrRNAseasy Plus Kit（Qiagen）を用いて抽出され、シーケンシング前にクオリティコントロールが行われた。RNAの完全性数値（RIN値）は全て6.0以上であった。

1. RNAシーケンシングとデータ処理

Illumina HiSeq 4000プラットフォームを利用してRNAシーケンシングを行い、193のサンプルからRNA-seqデータを取得した。このデータはMap-RSeq (v3.1.3) と STAR aligner (v2.5.2c)を用いて処理され、リードは参照ヒトゲノム(hg38)にマッピングされた。遺伝子とエクソンの発現量はSubread (v1.5.1)で計算され、未処理リードカウントおよびゲノム百万リード当たりの遺伝子発現数(RPKM)が得られた。

1. データ標準化と差次的な遺伝子発現解析

条件分位数標準化(CQN)を使用して低発現および無発現の遺伝子を除去した。次に、性別、遺伝子カウント、RIN値、年齢などの変数を考慮した線形回帰モデルを用いて差次的な遺伝子発現解析を行い、主要な5つの脳細胞タイプのマーカー遺伝子を共変量として使用した。

1. 共発現解析

加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)を使用してデータの共発現解析を行い、疾患状態に関連する遺伝子モジュールを識別した。異なるモジュールは異なる生物学的プロセスを表し、小分子代謝、ミトコンドリア構造、タンパク質局在などの過程に関連している。

1. 差次的スプライシング解析

LeafCutter (v0.2.6)を使用して差次的スプライシング解析を行い、多数の差次的スプライシングイベントを識別した。これには特定の遺伝子におけるエクソン・スキッピングやクリプティック・スプライシングが含まれる。

1. 免疫蛍光染色および確認実験

12のサンプルに対してOlig2+細胞の免疫蛍光染色を行い、デコンボリューション解析により見つかったオリゴデンドロサイトの割合の変化を確認した。部分的なクリプティック・エクソンはcDNAシーケンシングおよび長リードRNA-seqを用いて検証した。

主要結果

1. 遺伝子発現の差異

研究では、対照群と比べてc9orf72反復拡張患者において6911の遺伝子が顕著な差次的発現を示していることを発見した。これにはALSおよびFTLDに関連する既知の遺伝子（例：c9orf72、TARDBP〔TDP-43をコード〕およびFUSなど）が含まれる。疾患関連モジュールの共発現解析では、小分子代謝過程およびRNA処理経路が顕著な関連を示し、これらの生物学的経路が疾患において重要な役割を果たしていることを示唆している。

1. 転写スプライシングの変化

スプライシング解析では、ALSおよびFTLDに関連する遺伝子（例：CAMTA1およびDCTN1）における差次的スプライシングイベントを発見した。これらの遺伝子は同じ疾患スペクトラムで役割を果たしている。例えば、CAMTA1のエクソン・スキッピング現象はALSの生存期間の臨床修正因子に関連している。

1. クリプティック・エクソン

分析により、c9orf72反復拡張患者におけるクリプティック・エクソンが非c9orf72患者および対照群よりも顕著に多いことが示された。105のクリプティック・スプライシングイベントの内、77がc9患者に集中していた。さらなる研究により、これらのクリプティック・スプライシングイベントがRNA結合タンパク質（例：TDP-43）の発現レベルに関連している可能性が示された。

1. 細胞タイプの割合の変化

デコンボリューション解析および免疫染色の結果は、c9orf72反復拡張患者におけるオリゴデンドロサイトの割合が低下している可能性が示唆されており、これが疾患の病理メカニズムに関連している可能性がある。

研究結論

この研究は、c9orf72反復拡張患者の小脳における広範な転写組の変化、特に遺伝子発現およびRNAスプライシングの乱れを明らかにした。これらの発見は、顕著な神経細胞死がないにもかかわらず、ALSおよびFTLDの病理過程における小脳の重要な役割を示している。さらに、研究により既知および潜在的な疾患関連遺伝子の差次的発現およびスプライシングの変化が確認され、これら複雑な疾患の分子メカニズムを理解するための新しい視点が提供された。

研究は、異なる脳領域における転写組および機能研究の重要性を強調し、将来の研究方向を示している。例えば、単一細胞シーケンシングおよび長リードシーケンシング技術を活用して病理特徴と転写変化の間の関連をさらに探ることが挙げられる。

転写組データの深掘りにより、ALSおよびFTLDの異質性を理解するための新しい見解が提供され、将来的な治療戦略の開発に理論的な支持を与える可能性がある。