人間マイクログリアにおける形態特異的カルシウムシグナリング

2024-07-31 Wed
人間マイクログリアインビトロヒト脳組織モデルネイティブマイクログリア微小環境常在型マイクログリアの形態型 miRNA-9支援標識
ヒト小膠細胞における形態特異的なカルシウムシグナル特性の研究背景と研究目的小膠細胞は中枢神経系(CNS)の主要な免疫細胞であり、発達、シナプス伝達、神経可塑性、睡眠、外傷、膠芽腫、神経変性疾患などほぼすべての生理的および病理学的プロセスに関与しています。また、小膠細胞は危険関連分子パターン(DAMPs)と病原体関連分子パターン(PAMPs)を感知することで微小環境をモニタリングしています。小膠細胞は、多数の異なる膜受容体をコードする遺伝子（「小膠細胞センソーム」と呼ばれる）を発現し、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を検出することで、サイトカインやその他の炎症因子の生成と放出、細胞増殖、分化、遊走、貪食作用を引き起こします。マウスモデルでは、小膠細胞のカルシウム一過性シグナルは神経ネットワーク活動と密接に関連し、顕著な空間的区画化特性を示します。しかし、ヒト小膠細胞のカルシウムシグナル特性はまだ不明であり、ほとんどの研究は培養された初代細胞や誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の小膠細胞様細胞に限られています。
論文の出典と著者この研究はSofia Nevelchukらによって行われ、著者は主にドイツのテュービンゲン大学神経生理学部門（Department of Neurophysiology, Institute of Physiology, Eberhard Karls University of Tübingen）、ヘルティエ臨床脳研究所（Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen）、そしてマーティンスリードにあるマックス・プランク生物学的知能研究所（Max-Planck-Institute for Biological Intelligence, Martinsried）に所属しています。論文は2024年の『Journal of Neuroinflammation』誌に掲載されました。
研究方法とワークフロー組織サンプルの準備と培養研究サンプルは、6人の患者の外科手術中に切除された皮質組織から採取され、その後オルガノタイプ皮質スライスの作製に使用されました。これらのスライスは冷たい人工脳脊髄液中で保存され、1-2時間以内に培養膜に移され、その後ヒト脳脊髄液（hCSF）で培養されました。1.5mmの長さの神経幹細胞培地を用いて培養し、hCSFは3日ごとに交換されました。研究期間中、スライスはレンチウイルスベクターで形質導入され、3種類の異なる色の蛍光タンパク質（mCherry、mVenus、mTurquoise2）と新しく開発された遺伝子エンコードカルシウム指示薬mcyrfp1-caneonを発現し、小膠細胞のカルシウムシグナルを標識および分析しました。
新規カルシウム指示薬の開発と性能評価ヒト小膠細胞のカルシウムシグナルをモニターするために、研究チームは新しい遺伝子エンコード比率カルシウム指示薬mcyrfp1-caneonを開発しました。この指示薬は黄色-緑色蛍光タンパク質mNeonGreenと赤色蛍光タンパク質mcyrfp1を組み合わせたもので、一光子および二光子モードでのカルシウムイメージングが可能です。現在普及しているGCaMPsと比較して、caneonの蛍光タンパク質の明るさは高く、カルシウム結合部位が2つしかないため、より良い直線性とカルシウム緩衝負荷の低減を提供します。
カルシウムシグナル検出とデータ分析研究ではMATLABのBegoniaフレームワークを使用してカルシウムシグナルの活性ピクセル検出と分析を行いました。各ピクセルの蛍光値はバイナリ時系列に変換され、経験的に決定された閾値を使用して活性ピクセルを識別し、これらのピクセルをグループ化して活性領域（ROA）として定義しました。その後、各時点でのcaneonとmcyrfp1の平均蛍光値を計算し、カルシウム一過性変化の比率（δR/R）を計算して分析しました。
主な研究結果異なる形態の小膠細胞におけるカルシウムシグナル特性本研究では、ヒト小膠細胞に顕著なカルシウムシグナルの区画化特性が存在し、異なる形態の細胞でカルシウムシグナル特性が異なることが明らかになりました。研究では以下の側面からカルシウムシグナルの特性を詳細に記述しています：
基底カルシウムレベル：研究は、ヒト小膠細胞において、基底カルシウムレベルが異なる形態の細胞間で顕著に異なることを示しました。樹状小膠細胞の基底カルシウムレベルが最も低く、変形小膠細胞の基底カルシウムレベルは有意に上昇していました。
カルシウムシグナルの分布と頻度：カルシウムシグナルは樹状細胞では主に細胞突起領域に限局していましたが、変形細胞では大部分のカルシウムシグナルが細胞体に分布していました。さらなる分析により、樹状細胞の突起カルシウム一過性は高振幅で短時間持続する特性を持つのに対し、変形細胞のカルシウム一過性は高振幅だが長時間持続する特性を持つことが明らかになりました。
活性領域（ROAs）の特性：樹状細胞では、カルシウムシグナル活性領域が小さく、主に細胞突起に集中していましたが、変形細胞では活性領域が大きく、主に細胞体に位置していました。カルシウム一過性の振幅とAUCは3つの細胞形態すべてで異なり、特に樹状細胞と変形細胞間で顕著な差が見られました。
カルシウムシグナルの動力学特性頻度と振動挙動：樹状細胞と肥大（hypertrophic）細胞では、カルシウムシグナルの頻度が比較的低かったのに対し、変形細胞ではカルシウムシグナルの振動現象が頻繁に観察され、その頻度は約12.33×10^-3 s^-1でした。
運動とカルシウム一過性の関連：多くの樹状細胞と肥大細胞で顕著な突起運動が観察され、関連する領域で局所的なカルシウム一過性が示されました。ただし、15分間の記録中に細胞体の変位は観察されませんでした。
研究結論と価値この研究は、新しい遺伝子エンコードカルシウム指示薬、先進的なカルシウムシグナル検出および分析技術を用いて、ヒト小膠細胞（樹状、肥大、変形形態を含む）のその自然環境下におけるカルシウムシグナル特性を詳細に分析しました。研究で発見されたカルシウムシグナルの異なる区画化特性は、小膠細胞が生理的および病理学的プロセスで果たす具体的な機能を理解するための重要な手がかりを提供し、将来の神経系疾患研究に重要な指針を与えます。さらに、RGBマーキング法や新型カルシウム指示薬mcyrfp1-caneonなどの新しい技術的手段は、ヒト小膠細胞のさらなる研究のための強力なツールを提供しています。この研究は、ヒト小膠細胞のカルシウムシグナルダイナミクスの空白を埋め、異なる形態下での機能的異質性を示しました。
研究のハイライト新型遺伝子エンコードカルシウム指示薬：一光子および二光子カルシウムイメージングに適した新しい比率カルシウム指示薬mcyrfp1-caneonを開発しました。高輝度と良好な直線性を備え、既存のヒト小膠細胞カルシウムイメージング研究の重要なツールとなります。
カルシウムシグナルの区画化特性：ヒト小膠細胞におけるカルシウムシグナルの顕著な区画化特性と異なる形態間のカルシウムシグナルの差異を明らかにし、小膠細胞が異なる環境下で示す機能的応答の理解に役立ちます。
組織サンプルと培養技術：新鮮な術後ヒト皮質組織を利用し、ヒト脳脊髄液を用いたオルガノタイプ培養と組み合わせることで、小膠細胞の3つの主要な形態を成功裏に保持し、重要なin vitro研究モデルを提供しました。
研究の限界この研究はヒト小膠細胞のカルシウムシグナル分析において重要な進展を遂げましたが、いくつかの限界も存在します。組織サンプルがてんかんや腫瘍の手術由来であるため、完全に正常な健康組織を代表するものではありません。また、遺伝子エンコードカルシウム指示薬の発現にはオルガノタイプスライス培養が必要であり、これが細胞の機能特性を変える可能性があります。
この研究は技術的および方法論的に重要な breakthrough を達成し、将来のヒト小膠細胞の機能研究に貴重なデータと方法論的サポートを提供しています。