虚血条件下における炎症性小体の活性化がアストロサイトのアポトーシスとパイロトーシスを調節する

はじめに

虚血性脳卒中は脳損傷の主要なメカニズムの1つであり、局所的な脳領域が血流の中断により酸素と栄養が不足することが特徴です。近年の研究により、炎症反応が虚血性脳卒中において重要な役割を果たしていることが明らかになっています。炎症性小体（インフラマソーム）は細胞内の多タンパク質複合体で、主に炎症性カスパーゼ（caspase）を活性化し、IL-1βやIL-18などの炎症性サイトカインの成熟と分泌を促進することで炎症反応を駆動します。現在、多くの研究により、炎症性小体が虚血性脳卒中によって引き起こされるニューロンの死やミクログリアの活性化と細胞死に関与していることが確認されていますが、アストロサイトにおける調節メカニズムについてはまだあまり知られていません。

研究背景と動機

中枢神経系（CNS）において、アストロサイトは最も豊富なグリア細胞タイプであり、主に線維性アストロサイトと原形質性アストロサイトに分類されます。線維性アストロサイトは主に脳と脊髄の白質に存在し、軸索周囲の細胞外環境を調節する役割を担っています。一方、原形質性アストロサイトは主に灰白質に存在し、ニューロンに代謝サポートを提供します。低酸素虚血などの病理学的条件下では、アストロサイトの活性化、機能障害、および死亡が伝導障害と梗塞中心部の拡大を加速させます。反応性アストロサイト増殖（アストログリオーシス）はアストロサイトの虚血性損傷に対する典型的な反応であり、形態と機能の変化、およびGFAPと炎症マーカーの発現増加として現れます。しかし、虚血条件下でのアストロサイトにおける炎症性小体の発現と活性化に関する研究は不足しています。

この論文は、Lap Jack Wongらによる複数の機関からなる研究チームによって執筆されました。シンガポール国立大学、ラトローブ大学、成均館大学の科学者が含まれています。この論文は2023年8月30日に「Neuromolecular Medicine」誌にオンラインで公開されました。

研究方法

研究対象と実験デザイン

研究チームは、マウス由来の原形質性アストロサイト株（C8-D30）と線維性アストロサイト株（C8-D1a）を選択しました。これらの細胞は特定の培地で培養され、細胞が80-90%コンフルエントに達したとき、酸素グルコース欠乏（OGD）条件下に曝露され、虚血環境がシミュレートされました。

無糖ロック緩衝液を再補充し、細胞を95%窒素と5%二酸化炭素の雰囲気下に置くことで、その後1時間から24時間の異なる時点で細胞処理が行われました。さらに、異なる濃度（1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM）のcaspase-1阻害剤を投与することで、炎症性小体コンポーネントやアポトーシス、パイロトーシスマーカーへの影響が観察されました。

生化学的分析

実験終了後、細胞はPBSで洗浄され、スクレイピングされ、RIPA溶解緩衝液でタンパク質抽出が行われ、超音波処理により細胞溶解液が十分に均質化されました。BCAタンパク質定量キットを用いて総タンパク質濃度が測定されました。同様の方法が細胞培養上清中のタンパク質の沈殿と回収にも使用されました。SDS-PAGEとウェスタンブロット分析技術を用いて、炎症性小体コンポーネント、前駆体サイトカイン、細胞死マーカーの発現レベルが分析され、ImageJとGraphPad Prismソフトウェアを用いてデータの定量化と分析が行われました。

データ統計

一元配置分散分析（ANOVA）とBonferroniの事後検定により、グループ間の有意差が決定されました。実験データは平均値±標準誤差（SEM）で表され、統計的有意性の閾値はp < 0.05に設定されました。

研究結果

炎症性小体コンポーネントと前駆体サイトカインの発現

酸素グルコース欠乏条件下で、原形質性アストロサイトにおいてNLRP1、NLRC4、AIM2などのパターン認識受容体（PRRs）の発現レベルが有意に増加しました。さらに、時系列分析により、酸素グルコース欠乏条件が原形質性アストロサイトにおけるNLRP1、NLRC4、AIM2の発現を有意に上昇させ、NAIPが9時間時点で上昇傾向を示すことが明らかになりました。

対照的に、線維性アストロサイトでは酸素グルコース欠乏条件下でNLRP1とNLRC4の発現レベルに有意な変化はなく、NAIPの発現は相対的に減少しました。アダプタータンパク質ASCと総caspase-1、-8は時間点で有意に増加しましたが、前駆体IL-1βの発現は減少しました。

炎症性小体の活性化とそれによるアストロサイトの細胞死の促進

高輝度化学発光（ECL）ウェスタンブロット分析の対照下で、炎症性小体の活性化を示す切断型caspase-1、-8、成熟IL-1βとIL-18は酸素グルコース欠乏条件下で発現の増加を示し、炎症性小体の活性化を示しました。さらなる分析結果から、酸素グルコース欠乏条件下で、アポトーシス（切断型caspase-3）とパイロトーシス（N末端gasdermin D）および二次的パイロトーシス（N末端gasdermin E）の細胞死マーカーの発現も有意に増加することが明らかになりました。

さらに、この実験では、アストロサイトが酸素グルコース欠乏条件下で炎症性小体コンポーネントを培養上清に放出し、さらに細胞外炎症性小体の活性化を実現して炎症反応を推進できることも発見されました。

caspase-1阻害の炎症性小体活性化とアストロサイト細胞死への影響

caspase-1阻害剤の段階的濃度処理により、酸素グルコース欠乏条件下での炎症性小体の活性化と細胞死を効果的に抑制できることが分かりました。具体的には、切断型caspase-1と成熟IL-1βの発現が減少し、同時にアポトーシスとパイロトーシスマーカーの発現も有意に低下しました。

結論

以上をまとめると、本研究は酸素グルコース欠乏条件下で炎症性小体がアストロサイトの炎症反応と細胞死の重要な調節因子として機能することを確立しました。caspase-1の阻害により、アポトーシスとパイロトーシスによる細胞死を効果的に減少させることができ、炎症性小体が虚血性脳卒中誘発性アストロサイト死の新しい治療ターゲットになる可能性を示唆しています。しかし、将来的には in vivo 研究によってこれらの発見をさらに検証し、脳虚血条件下でのアストロサイトにおける炎症性小体のダイナミックな役割をより深く理解する必要があります。本研究は将来の関連研究のための堅固な基盤を築くと同時に、今後の研究の重要な方向性を示しています。

研究のハイライト

1. 虚血条件下での炎症性小体活性化の原形質性および線維性アストロサイトへの異なる影響：研究は初めて、虚血条件下での異なるサブタイプのアストロサイトにおける炎症性小体の発現と活性化効果を詳細に探究しました。
2. 細胞外での炎症性小体の作用の解明：アストロサイトが酸素グルコース欠乏条件下で炎症性小体コンポーネントを放出することで、さらに炎症反応を推進できることを証明しました。
3. caspase-1阻害剤の効果的な応用：薬理学的手段による炎症性小体の調節は、虚血性脳卒中後のアストロサイト細胞死の治療に新しい研究方向と潜在的な治療経路を提供しました。

研究の価値

この研究は、虚血条件下での炎症性小体の役割を明らかにしただけでなく、将来の抗炎症治療戦略開発のための重要な手がかりを提供しました。特に、アストロサイト保護と神経炎症の軽減に関して、研究結果はcaspase-1阻害剤の潜在的な応用価値を示し、虚血性脳卒中患者の予後改善に新しい視点を提供しました。