CD137L 阻害は敗血症関連脳症のマウスモデルにおける海馬神経炎症および行動障害を改善する

2024-08-07 Wed
背景紹介敗血症（Sepsis）は、宿主体内の制御不能な感染によって引き起こされる生命を脅かす多臓器機能障害症候群であり、集中治療室における死亡の主要な原因の一つです。報告によると、10万人年あたり約189例の成人敗血症入院症例があり、死亡率は26.7%に達します。敗血症関連脳症（Sepsis-Associated Encephalopathy、SAE）は、末梢または全身の炎症性感染によって引き起こされる中枢脳機能障害です。重度の敗血症患者の約70%がSAEに進行し、これにより死亡率が上昇し、入院期間が延長し、過剰な医療資源の消費をもたらします。その症状は譫妄から昏睡まで幅広く、早期診断と介入が敗血症患者の治療に不可欠です。しかし、SAEの病理メカニズムは完全には解明されていません。
ミクログリアは中枢神経系（CNS）の常在マクロファージであり、SAEの発病機序と密接に関連しています。制御不能な神経炎症はSAEの主要な特徴であり、この状態下での脳機能異常と神経細胞死の主な原因でもあります。研究によると、SAE期間中のミクログリアの活性化は、情動障害、不安、抑うつ、認知障害と密接に関連しています。敗血症動物モデルでは、ミクログリアは通常リポ多糖（LPS）刺激によって活性化され、SAE関連の行動変化の仲介において重要な役割を果たします。ミクログリアの活性化状態は、M1とM2の2つの主要な表現型に分類されます。M1ミクログリアは組織と神経の損傷に関連する炎症促進因子を産生し、M2ミクログリアは抗炎症因子を産生し、組織と神経の修復を促進します。
CD137L（TNFSF9、4-1BBL）は腫瘍壊死因子（TNF）リガンドファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質で、適応免疫応答において重要な役割を果たします。研究によると、CD137Lシグナルをブロックすることで神経炎症メディエーターの放出を減少させることができ、CD137L欠損マウスではほとんど神経変性疾患が発生しないことが示されています。この背景のもと、本論文の著者らは、CD137受容体/リガンドシステムがミクログリアの極性状態を調節することで、SAE誘導性の神経炎症と認知行動障害に影響を与えるという仮説を立てました。
論文の出典この研究論文はFang Qiuらによって執筆され、著者は深圳龍華区中心病院、中国科学院深圳先進技術研究院、広東医科大学など、中国の複数の研究機関に所属しています。論文は2023年10月5日に「Neuromolecular Medicine」誌上で発表されました。
研究過程敗血症関連脳症マウスモデルの確立研究は動物研究の倫理ガイドラインを厳守し、広東医科大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。実験では成体雄C57BL/6マウスを使用し、LPS (2 mg/kg)の腹腔内注射によってSAEモデルを確立しました。行動試験開始の24時間前にLPS注射を行いました。マウスは3群に分けられました：対照群（Ctrl）、LPS処理群（LPS）、およびLPS+TKS-1処理群（LPS+TKS-1）。LPS+TKS-1群のマウスはCD137L中和抗体TKS-1 (200 µg) で処理されました。
行動試験すべての行動試験は恒温室内で、光周期中に行われ、実験者と分析者は実験群の割り当てについてブラインド処理されました。行動試験にはオープンフィールドテスト（OFT）、高架式十字迷路試験（EPM）、Y字迷路自発的交替行動試験が含まれ、マウスの不安様行動と空間記憶能力を評価しました。
細胞培養および処理実験に使用されたBV2ミクログリア細胞株は深圳大学から入手しました。CD137L/CD137シグナル軸のミクログリアにおける役割を検証するために、リコンビナントCD137-Fc融合タンパク質とCD137L中和抗体TKS-1を用いて細胞実験を行いました。
フローサイトメトリーBV2細胞においてフローサイトメトリーを用いてLPSのCD137L発現への影響を検出しました。細胞は以下のように群分けされました：対照群（Ctrl）、LPS処理群（LPS）、TKS-1+LPS処理群（TKS-1+LPS）。その後、適切なAlexa Fluor色素で標識された二次抗体を用いて検出を行いました。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）BV2細胞の培養上清とマウス海馬組織は-80°Cで処理のために保存されました。ELISAキットを用いてサイトカインとタンパク質発現レベルを検出しました。
免疫蛍光染色免疫蛍光染色を用いて、実験群マウスの海馬におけるIba1、CD137L、TNF-α、IL-6の発現および共局在を検出しました。
リアルタイム定量PCR (RT-qPCR)マウス海馬またはBV2細胞から総RNAを抽出し、RT-qPCRを実施しました。RT-qPCRを用いてミクログリア活性化マーカー遺伝子および炎症因子の相対発現レベルを測定しました。
データ分析すべてのデータはGraphPad Prism 7ソフトウェアを用いて分析されました。2群間の比較には両側t検定を、多群間の比較には一元配置分散分析（ANOVA）を使用しました。
主な結果研究では、LPS処理後、マウスの海馬においてCD137Lの発現が有意に上昇し、ミクログリアで顕著に発現していることが明らかになりました。同時に、CD137L中和抗体TKS-1の前処理により、CD137Lレベルが有意に低下し、炎症促進因子（TNF-α、IL-1β、IL-6など）の発現とミクログリアのM1極性化が抑制されました。さらに、CD137-Fc融合タンパク質はBV2ミクログリアにおける炎症促進因子の合成と放出を活性化しました。行動面では、TKS-1の投与によりLPS誘導性の不安様行動と空間記憶の低下が有意に緩和されました。
これらの結果は、ミクログリアにおけるCD137Lの上昇がLPS誘導性の神経炎症、不安様行動、認知機能障害に関与していることを示唆しています。したがって、CD137L/CD137シグナル経路の調節は、敗血症関連脳損傷を軽減し、認知および情動障害を予防するための有効な方法となる可能性があります。
研究の意義本研究は、CD137LがLPS誘導性の敗血症関連脳症において、ミクログリアの極性状態を調節することで神経炎症と認知行動障害に影響を与える重要な役割を明らかにしました。この発見はSAEの治療に新たな視点を提供し、特にCD137Lシグナル経路を標的とすることで、敗血症および SAEの臨床治療に重要な理論的基盤と臨床応用の可能性を提供する可能性があります。
研究のハイライト重要な発見：敗血症関連脳症におけるCD137Lの重要な役割を初めて実証しました。
高い影響力：研究結果は敗血症関連脳症の理解と治療に重要な意義を持ちます。
革新的な方法：実験で使用されたCD137L中和抗体TKS-1は、神経炎症を標的とする上で効果的であることを示し、新たな治療法を提案しました。
本論文の研究を通じて、科学者たちは敗血症関連脳症におけるミクログリアの作用メカニズムをさらに理解し、将来的にSAEの効果的な治療法を開発するための重要な実験データと理論的サポートを提供しました。