使用多重液滴数字PCR检测八种癌症的方法

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多癌种检测的多重液滴数字PCR甲基化检测方法

背景介绍

癌症是全球范围内导致死亡的主要原因之一，2020年报告的死亡人数接近1000万。尽管许多癌症在早期发现和治疗时可以治愈，但许多患者仍被诊断为晚期，导致治疗效果不佳。目前，大多数西方国家仅针对结直肠癌、乳腺癌和宫颈癌开展了筛查项目，而其他癌症类型缺乏有效的早期检测手段。因此，开发一种能够同时检测多种癌症的早期诊断工具具有重要意义。

DNA甲基化（DNA methylation）是一种在癌症早期就发生改变的生物标志物，具有高度的稳定性和一致性。与突变不同，甲基化模式在癌症细胞和正常细胞之间存在显著差异，且这些差异在癌症发生早期就已出现，因此甲基化检测被认为是早期癌症诊断的理想工具。近年来，液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）技术因其高灵敏度和绝对定量能力，在甲基化检测中得到了广泛应用。然而，此前尚未有研究利用多重ddPCR技术进行多癌种检测。

论文来源

这篇论文由来自比利时安特卫普大学和安特卫普大学医院的研究团队完成，主要作者包括Isabelle Neefs、Nele De Meulenaere、Thomas Vanpoucke等。论文于2024年9月6日在线发表在《Molecular Oncology》期刊上，DOI为10.1002⁄1878-0261.13708。

研究流程与结果

1. 目标选择与实验设计

研究团队基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的数据，筛选出1792个差异甲基化的CpG位点，并从中选择了40个具有显著差异的位点进行进一步分析。最终，研究团队确定了三个甲基化靶点（target 1、target 2和target 3），并开发了两种ddPCR检测方法：一种为三重检测（triplex assay），用于同时检测target 1和target 2；另一种为双重检测（duplex assay），用于检测target 3。

2. 样本收集与处理

研究团队收集了103个肿瘤样本和109个正常邻近组织样本，涵盖八种常见癌症类型：肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌和食管癌。所有样本均经过病理学家的显微镜检查，确认组织类型和肿瘤细胞百分比（tumor cell percentage, TCP）。DNA提取后，使用亚硫酸氢盐转化（bisulfite conversion）技术处理样本，以区分甲基化和非甲基化的DNA。

3. ddPCR检测方法的优化

研究团队通过温度梯度和探针浓度梯度优化了ddPCR检测方法。三重检测的最佳温度为55°C，探针浓度分别为450 nM（target 1）、680 nM（target 2 - FAM）和1.4 µM（target 2 - SUN）。双重检测的最佳温度为58°C，探针浓度为2.93 µM。优化后的检测方法在阳性和阴性对照中表现出良好的重复性和灵敏度。

4. 甲基化分析

研究团队使用优化后的ddPCR检测方法对103个肿瘤样本和109个正常邻近组织样本进行了甲基化分析。结果显示，所有癌症类型（除结直肠癌外）在target 1上均表现出显著的甲基化差异。target 2和target 3在所有癌症类型中也显示出显著的甲基化差异。特别是肺癌和胰腺癌的甲基化差异最为显著。

5. 灵敏度与特异性分析

通过接收者操作特征曲线（receiver-operator characteristic, ROC）分析，研究团队评估了每个靶点的灵敏度和特异性。结果显示，单独使用target 1的灵敏度为82.5%，特异性为98.2%；单独使用target 2的灵敏度为76.6%，特异性为93.6%。然而，当结合使用target 1和target 2时，灵敏度提高到93.2%，特异性为92.7%。进一步结合target 3后，整体检测的灵敏度达到94.1%，特异性为87.3%。

结论与意义

这项研究首次报道了一种基于多重ddPCR技术的多癌种甲基化检测方法。该方法通过结合三个甲基化靶点，能够在八种癌症类型中实现高灵敏度和高特异性的检测，整体检测的曲线下面积（AUC）达到0.948。这一成果为未来开发基于液体活检的多癌种早期诊断工具奠定了基础。

研究亮点

  1. 多癌种检测：该研究首次利用多重ddPCR技术实现了对八种癌症类型的甲基化检测，具有广泛的应用前景。
  2. 高灵敏度与特异性：通过结合多个甲基化靶点，显著提高了检测的灵敏度和特异性，尤其是在肺癌和胰腺癌中表现尤为突出。
  3. 优化检测方法：研究团队通过温度梯度和探针浓度梯度优化了ddPCR检测方法，为未来开发更高效的多重检测方法提供了参考。

未来展望

研究团队计划进一步评估该方法在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本和液体活检中的应用效果，以验证其在临床诊断中的实际应用价值。此外，随着Bio-Rad公司QX600系统的推出，未来有望实现更多靶点的多重检测，进一步提高检测的灵敏度和特异性。

致谢

研究团队感谢所有患者和安特卫普大学医院生物样本库的贡献，并特别感谢实验室技术员Anne Schepers在样本处理中的工作。该研究得到了安特卫普大学和比利时研究基金会（FWO）的支持。

这篇研究为癌症早期诊断提供了新的工具和方法，具有重要的科学和临床应用价值。未来，随着技术的进一步发展，这种多癌种检测方法有望在临床实践中得到广泛应用，帮助更多患者实现早期诊断和治疗。