胰岛素受体底物的NEDD化作为胰岛素信号调控器及其对癌细胞迁移的影响

学术背景

近年来，癌症与糖尿病之间的关联备受关注，主要归因于其重叠的病理学机制和流行病学联系。流行病学研究表明，2型糖尿病（T2DM）患者患多种癌症的风险显著增加，包括胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌和卵巢癌等。胰岛素调节失常是2型糖尿病的一个显著特征，这种失常干扰了胰岛素信号通路，被认为是多种癌症发展的风险因素。

在胰岛素信号传导中，胰岛素受体底物1和2（IRS1和IRS2）起着关键作用，作为胰岛素效应传导到细胞过程的中介。在癌细胞中，IRS蛋白在胰岛素与胰岛素受体结合时被激活，引发复杂的信号级联反应。与正常组织相比，癌症中IRS蛋白水平更高，表明其可能参与肿瘤发生。大多数癌症类型也表现出IRS蛋白的高表达，提示这些蛋白在癌症中的多样化和上下文依赖的角色。

随着对IRS蛋白激活机制的理解不断深入，后翻译修饰（如磷酸化、泛素化、O-GlcNAc化和乙酰化）被认为是调节IRS蛋白活性和与下游效应器相互作用的关键因素。为了深入了解这些修饰的调控功能，进一步研究IRS蛋白的后翻译修饰显得尤为重要。

研究来源

本研究由Seoul National University College of Medicine与Yokohama National University等机构的研究人员合作完成，相关研究成果发表于《Cancer Gene Therapy》杂志。

研究方法

人体组织和细胞培养

研究在严格遵循《赫尔辛基宣言》的情况下，收集了来自高分化和低分化卵巢癌患者的组织样本。具体的是从2019年至2022年之间在SNUH病理部门进行的手术切除过程中获得的样本。细胞培养方面，使用了HEK293、SKOV3、U373和RCC4等细胞系。

差异基因表达和富集分析

通过火山图和GSEA结合方法，研究了低等级和高等级卵巢癌患者中差异表达的基因，确定了关键的差异基因和通路。结果表明，低等级卵巢癌患者中NEDD化酶NAE1的mRNA水平显著高于高等级卵巢癌患者，纳入了细胞对胰岛素刺激和低等级卵巢癌下调基因集的富集分析也支持了这一发现。

蛋白鉴定和免疫组化分析

利用LC-MS/MS分析方法鉴定了差异表达的蛋白（DEPs），并结合KEGG数据库进行通路分析确定关键蛋白IRS1在生物功能富集中的重要角色。进一步的免疫组化分析显示，在胰岛素和NEDD化抑制剂处理下，IRS1和IRS2的表达水平显著增加。

迁移实验和定量PCR（RT-qPCR）

进行了细胞迁移实验（包括穿膜和伤口愈合实验）评估了NEDD化抑制和胰岛素处理对细胞迁移的影响。此外，采用RT-qPCR方法分析了IRS1和IRS2的mRNA水平，结果显示，尽管蛋白水平增加，但NEDD化抑制和胰岛素联合处理并未影响IRS1和IRS2的mRNA表达水平。

稳定性实验和蛋白质沉淀实验

通过使用环己酰亚胺（CHX）处理，研究了胰岛素在NEDD化阻断下对IRS1和IRS2蛋白稳定性的影响，结果显示，联合处理显著增加了IRS1和IRS2的稳定性。此外，蛋白质沉淀实验验证了NEDD化和泛素化在IRS1和IRS2蛋白稳态调控中的顺序性关系。

研究结果

NEDD化与卵巢癌胰岛素刺激的负相关性

研究发现，NEDD化和卵巢癌恶性程度之间存在负相关关系，特定NEDD化酶NAE1的低表达与胰岛素刺激反应增加有关，提示NEDD化在胰岛素信号传导中的重要调控作用。

IRS蛋白水平与卵巢癌预后不良的关系

蛋白鉴定结果显示，在高水平胰岛素刺激下，NEDD化抑制显著增加了IRS1和IRS2的蛋白表达水平。此外，在卵巢癌患者样本中，IRS1和IRS2的高表达与较低的总生存率相关，特别是在伴有T2DM的卵巢癌患者中，IRS1和IRS2表达水平显著增加。

细胞迁移和耐糖不良纳入的调控

在三种癌细胞系中，研究表明，NEDD化抑制和胰岛素共同处理显著增强了细胞迁移能力，并通过IRS1和IRS2激活PI3K/AKT信号通路。IRS蛋白的上调进一步促进了癌细胞的迁移，且IRS1和IRS2可能通过独立的机制发挥作用。

C-CBL作为E3连接酶的作用

研究验证了C-CBL作为IRS1和IRS2的NEDDylation E3连接酶的功能，通过与IRS蛋白的相互作用促进其NEDD化，进而调控其降解和稳定性。Knockdown实验提示C-CBL缺失显著增加了IRS1和IRS2的表达和癌细胞迁移，而共同knockdown IRS1和IRS2则减弱了上述效应。

结论

本研究阐明了NEDD化在胰岛素信号传导和癌细胞迁移中的调控作用，进一步强调了C-CBL在这其中的关键角色。研究表明，胰岛素信号失调显著影响IRS蛋白的稳定性，通过NEDD化调控IRS1和IRS2的降解，为癌症治疗提供了新的潜在靶点。然而，考虑到NEDD化抑制剂的抗癌效果，在T2DM或高胰岛素血症患者中使用NEDD化抑制剂时需谨慎。

研究亮点

1. NEDD化与胰岛素信号传导的负相关性：发现NAE1低表达与胰岛素刺激反应增加有关，强调NEDD化对胰岛素信号传导的调控作用。
2. IRS蛋白与癌症预后的关联：IRS1和IRS2高表达与卵巢癌患者较差预后相关，特别是在T2DM患者中，更为显著。
3. C-CBL的关键作用：C-CBL作为IRS蛋白的NEDDylation E3连接酶，调控其稳定性，显著影响癌细胞的迁移能力。
4. 方法学创新：结合多种实验技术，包括LC-MS/MS、免疫组化、细胞迁移实验和蛋白质沉淀实验，全面解析了IRS蛋白的NEDD化机制。

研究意义

本研究不仅揭示了NEDD化在胰岛素信号传导中的重要地位，还为治疗糖尿病和癌症提供了新的视角和潜在靶点。NEDD化及其调节分子（如C-CBL）的深入研究可能有助于开发新的癌症治疗策略，特别是针对伴有胰岛素信号失调的癌症患者。