迷你G蛋白阻止SameGPCR的内化并破坏下游细胞内信号传导

引言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的一类跨膜蛋白，调控着细胞对外界刺激（如激素和神经递质）的反应。GPCR通过连接鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白（G蛋白）进行信号传递。激动剂的结合引起受体构象的变化，进而激活三聚体G蛋白复合物，由这种变化引发的信号传导链能导致具体的细胞效应。信号传递完成后，通过固有的GTP酶活性，Gα亚基会返回到其不活跃的GDP结合状态。

近年来，为了更好地研究GPCR的结构，科学家们采用了共表达与其相应的热稳定Gα亚基迷你G蛋白的策略。这些迷你G蛋白能够稳定GPCR的活性构象。然而，如今迷你G蛋白的使用越来越广泛，因此需要谨慎地定义迷你G共表达对GPCR内化和细胞内信号传导的潜在影响。

研究来源

本文由Yusman Manchanda等撰写，作者分别来自Imperial College London，Tohoku University和Université de Montréal等机构。文章于2024年7月2日发表在Science Signaling期刊上。

实验方法

作者报告了迷你G蛋白与其相应GPCR的过度表达会导致GPCR内化障碍和相关细胞内信号传导的破坏。为了深入研究这一现象，作者进行了以下几个实验步骤：

实验流程

1. GPCR与迷你Gs共表达实验：

   • 在表达Gαs偶联的GPCR胰高血糖素样肽1受体（GLP-1R）的HEK293细胞中，进行了迷你Gs与GLP-1R的共表达。使用荧光或发光标签标记了迷你Gs和GLP-1R，观察其在细胞中的分布和内化情况。

2. 纳米发光共振能量转移（NanoBRET）实验：

   • 在共表达迷你Gs和GLP-1R的HEK293细胞中，使用NanoBRET技术测量不同时间点的能量转移，来监测迷你Gs的膜重，内化和细胞内信号传导。

3. 荧光共定位显微镜分析：

   • 利用分步共定位技术在HEK293和INS-1 832/3细胞中，观察迷你Gs和GLP-1R与早期内吞标志物Rab5的共定位情况。

4. β-忽视和GRK2募集：

   • 使用NanoBRET和NanoBiT技术检测β-忽视蛋白2和GRK2（GPCR激酶2）在共表达迷你Gs时的募集情况：

     • 在GLP-1R上使用β-忽视蛋白2和GRK2的荧光标签测定每种状况下的能量转移，监测不同条件下β-忽视蛋白2和GRK2的募集。

研究结果

1. 迷你Gs抑制GLP-1R内化：

   • 主要发现一：在有迷你Gs共表达的细胞中，GLP-1R在激动剂作用下不可有效内化。
   • 数据支持：NanoBRET实验和共定位显微镜分析显示，随着时间的推移，NanoBRET信号未随GLP-1R内化减弱，表明迷你Gs持续驻留在细胞膜上。

2. 迷你G亚基选择性抑制其相应GPCR内化：

   • 共表达不同类型的迷你G蛋白（迷你Gi和迷你Gq）均能够抑制其相应的GPCRs的内化。
   • 迷你G亚基共表达未能有效抑制内源性Gα的作用，即全长Gα亚基与迷你G蛋白相比，前者对于GPCR内化的影响较小。

3. β-忽视蛋白2的募集受影响：

   • β-忽视蛋白2完全抑制表明β-忽视蛋白2募集需要Gα亚基的解离，而GRK2的募集仅轻微受影响，不会显著改变GLP-1R的磷酸化状态。

4. 迷你G蛋白对GPCR-配体结合亲和力的影响：

   • 在共表达迷你Gs的细胞中，GLP-1R的配体结合亲和力有所增加，这意味着受体会保持在稳定的活性构象中。

结论和价值

这项研究首次揭示了迷你G蛋白的共表达对其相应GPCR的内化及下游信号传导的影响。关键发现之一是迷你G蛋白能够阻止GPCRs内化，从而改变其细胞内信号传导的特性。此外，这项研究的影响包括对设计新的GPCR信号传导评估方法的重要启示，引导未来实验中避免迷你G亚基过表达的误解，从而提高GPCR的分子药理学和信号传导研究的准确性。

研究的亮点和创新

不同迷你G亚基在共表达迷你G蛋白后的选择性内化抑制是首次报道。这一发现不仅在学术研究中具有重要意义，也可以推动新型药物靶点的发现和疗法的开发。此外，论文提出了一种使用纳米抗体Nb37的新方法，可在不影响GLP-1R内化的情况下，更为精准地检测细胞内信号传递。

小结

本文揭示了迷你G蛋白对其相应GPCR内化和下游信号传导的显著抑制作用，为未来GPCR信号传导的研究提供了新的视角和方法。通过这些深入的实验和观察，本文为科学界提供了宝贵的数据，加深了人们对GPCR信号传导机制的理解。