脑源性外泌体环状RNA在血浆中作为急性缺血性脑卒中的诊断生物标志物

急性缺血性卒中（AIS），通常被称为中风，是一种严重的疾病，其特征是血流中断进入大脑，导致组织损伤和神经功能缺失。早期诊断对于有效的干预和管理至关重要，因为及时治疗可以显著改善患者的预后。因此，急需开发用于早期诊断AIS的新方法。多项研究表明，外泌体中包含的生物活性分子，尤其是环状RNA（circRNA），可以作为多种疾病的理想标志物。然而，关于外泌体及其circRNA对AIS发展和预后的研究较为稀少。因此，本文旨在探索使用血浆脑源性外泌体中的circRNA作为AIS的生物标志物的可行性。

研究背景

AIS是全球致残和死亡的主要原因之一。据统计，每年因急性缺血性卒中导致的死亡和长期残疾人数相当庞大。目前临床上急性缺血性卒中的主要处理方法是尽快再通阻塞的血管，尤其是在发作后的24小时内，因为此时再灌注可以挽救缺血半影组织。然而，现有的多模式成像方法虽然可以预测缺血半影的存在，但依赖高端设备和设施的限制使其在偏远地区的应用受到阻碍，因此开发一种快速且广泛可及的诊断方法是非常重要的。

circRNA是一类非编码RNA，尤其在脑组织中广泛存在。circRNA通过长RNA转录物的回旋拼接产生，并以其形成后的高稳定性闻名。体液中的外泌体被广泛认为是理想的生物资源，可以用来开发诊断生物标志物。研究发现外泌体中富含circRNA，并且这些circRNA在外泌体中的稳定性和富集度很高，这表明它们在生物功能和应用中具有重要意义。

研究来源

本文由Xinli Jiang、Rui Zhang、Geng Lu、Yu Zhou、Jianfeng Li、Xinrui Jiang、Shuangshuang Gu、Hongwei Liang、Jun Wang等研究人员共同完成。研究发表于2024年的Journal of Neuroimmune Pharmacology期刊。

研究方法

样本收集与处理

研究共有172名疑似中风患者和67名非中风对照组参与，其中部分样本用于高通量测序，其余用于实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证。样本于症状出现后72小时内收集，所有患者在入院后即刻采集血样，且都基于磁共振成像（MRI）或延迟计算机断层扫描（CT）进行确诊。

外泌体的分离与分析

通过高通量测序方法，我们首先从脑梗患者的血浆脑源性外泌体中识别出358个表达失调的circRNA（包括23个显著上调和335个显著下调的circRNA）。使用Streptavidin磁珠和生物素标记的抗体从血浆中分离特定的脑细胞外泌体。

随后，我们通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹（Western blotting）对外泌体进行进一步的形态学和标记蛋白分析。结果显示，这些外泌体富含外泌体标志物CD63以及脑源性外泌体特异性标志物L1CAM、GLAST和TMEM119。

数据分析

在Bioinformatics和Statistical分析中，使用Circexplorer2对circRNA序列数据进行分析和注释，进行定量归一化和低强度滤波，并通过边缘软件（EdgeR）筛选差异显著的circRNA表达数据。

qRT-PCR验证

为验证高通量测序结果，在172名AIS患者和67名非AIS对照组中，选择了5种上调的circRNA（包括hsa_circ_0007290、hsa_circ_0049637、hsa_circ_0000607、hsa_circ_0004808和hsa_circ_0000097）进行qRT-PCR验证。结果显示，这五种circRNA在AIS患者的血浆脑源性外泌体中的表达水平显著高于非AIS对照组。

ROC曲线分析

通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，结果显示hsa_circ_0007290、hsa_circ_0049637、hsa_circ_0000607、hsa_circ_0004808和hsa_circ_0000097的曲线下面积（AUC）分别为0.8317、0.8480、0.8973、0.8563和0.8772，表明这些circRNA具有较高的特异性和灵敏度。当这五种circRNA的组合用于区分AIS患者和非AIS对照组时，AUC值高达0.9209，诊断敏感性和特异性分别为95.08和80.65。

主要结果

研究发现，这五种circRNA在AIS患者的血浆脑源性外泌体中显著上调，且其表达水平与国家卫生研究院卒中量表（NIHSS）和改良Rankin量表（mRS）评分呈正相关。这表明这些circRNA不仅可以作为AIS的早期诊断标志物，还可以用于评估病情进展。

结论与意义

本研究首次揭示，血浆脑源性外泌体中的circRNA（hsa_circ_0007290、hsa_circ_0049637、hsa_circ_0000607、hsa_circ_0004808和hsa_circ_0000097）可以作为AIS的理想诊断标志物，并且可能成为治疗干预的潜在靶点。然而，由于目前数据仅基于约200名参与者，还需更多的样本来进一步评估和验证这些发现。

本研究为AIS的快速诊断提供了新的思路和方法，具有重要的科学价值和临床应用前景。通过进一步的研究，可能会为AIS的早期诊断和治疗提供新的手段，改善患者的预后。