TLR7在神经元中通过NF-κB诱导CCL2的表达

研究背景

Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）是识别微生物特定分子结构的重要机制之一。在人类中，已知有十种TLRs（TLR1-10），其中TLR3和TLR7位于内体膜上，分别在感知病毒衍生的核酸和诱导抗病毒免疫反应中起着重要作用（Nishiya et al., 2005）。TLR3识别双链RNA（dsRNA），而TLR7可以结合单链RNA（ssRNA）和咪唑喹啉衍生物（Alexopoulou et al., 2001; Diebold et al., 2004; Hemmi, 2002）。目前，TLR7在中枢神经系统（CNS）中的免疫反应仍不完全清楚，但最近的研究表明，TLR7在对抗神经营养病毒如西尼罗河病毒（WNV）和Langat病毒的先天免疫中起着关键作用（Town et al., 2009; Baker et al., 2013）。中枢神经系统的主要细胞类型，如星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元，都表达TLR7（Gern et al., 2021）。星形胶质细胞和小胶质细胞中TLR7信号通路的激活对于对抗神经营养性病毒的免疫反应至关重要（Luo et al., 2019; Mukherjee et al., 2019）。此外，TLR7/8激动剂Resiquimod（一种咪唑喹啉化合物）激活小胶质细胞，产生包括C-C基序趋化因子配体2（CCL2）在内的促炎性趋化因子（Kwon et al., 2022）。类似于胶质细胞，神经元也表达TLR7（Gern, 2021; Lehmann et al., 2012），这表明它们可以在响应TLR7配体时激活免疫系统。然而，神经元中TLR7表达的意义尚不明确。因此，本研究旨在确定Resiquimod是否能在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中诱导炎症性趋化因子的表达。

研究来源

本文题为“Resiquimod在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过NF-κB诱导CCL2的表达”，由Masatoshi Kaizuka, Shogo Kawaguchi, Tetsuya Tatsuta, Mayuki Tachizaki, Yuri Kobori, Yusuke Tanaka, Kazuhiko Seya, Tomoh Matsumiya和Tadaatsu Imaizumi等研究人员撰写，分别隶属于Hirosaki University Graduate School of Medicine的胃肠病学和血液学系、脑科学研究所血管生物学系、呼吸科医学系和健康科学系。论文发表于2024年在“Neuromolecular Medicine”期刊的第26卷中，文章编号16。本文的通讯作者为Shogo Kawaguchi，联系邮箱为kawaguchi.s@hirosaki-u.ac.jp。

研究内容与流程

本研究通过详细实验设计和数据分析，逐步揭示了Resiquimod在SH-SY5Y细胞中诱导CCL2的表达机制。

实验流程

1. 细胞培养： SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系在含有10％胎牛血清（FBS）和100mg/ml青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养。为获得分化的SH-SY5Y细胞，细胞在补充10µM全反式视黄酸的培养基中培养6天，期间每2天换一次培养基。

2. 免疫荧光显微镜（IF）： 通过IF显微镜确定SH-SY5Y细胞中TLR7的表达。固定细胞后，用特异性抗体进行免疫染色，观察光镜下的TLR7、TLR3和核因子-κB（NF-κB）p65的定位和表达情况。

3. 定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）： 从细胞中提取总RNA，合成单链cDNA，并用特定引物进行qRT-PCR分析，评估CCL2、CXCL8和CXCL10的mRNA水平。

4. Western Blotting： 通过西方印迹法检测细胞裂解液中IκB-α、p-p65、p65和Actin的表达，评估NF-κB信号途径的活化。

5. 酶联免疫吸附法（ELISA）： 收集细胞培养上清液，用ELISA试剂盒测定CCL2、CXCL8和CXCL10的蛋白水平。

6. RNA干扰（RNAi）： 缓冲液中用脂质体转染Reagent将p65 siRNA或负对照siRNA转染至SH-SY5Y细胞，检测p65的敲降对Resiquimod诱导的CCL2表达的影响。

研究结果

1. 基础表达： IF显微镜结果显示，TLR7和TLR3在SH-SY5Y细胞中恒定表达，并定位于细胞核附近。Resiquimod和Poly IC刺激后，CCL2、CXCL8和CXCL10的mRNA水平迅速上调。

2. 基因表达上调： Resiquimod诱导CCL2、CXCL8和CXCL10的表达呈现浓度依赖性，ELISA检验结果表明Resiquimod显著增加了CCL2的分泌，而CXCL8和CXCL10变化较小。

3. NF-κB依赖性： Western blot结果显示，Resiquimod显著增加p-p65的表达，并导致p65的细胞核转位。RNAi实验进一步表明，敲降p65显著减少Resiquimod诱导的CCL2的表达和分泌。

研究结论

本研究首次揭示了Resiquimod在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中通过激活NF-κB途径显著诱导CCL2的表达。CCL2通过其受体CCR2在中枢神经系统的免疫反应中发挥关键作用。结果表明，Resiquimod具有通过其免疫刺激作用在中枢神经系统病毒感染中作为潜在治疗剂的应用前景。

研究亮点

本研究的主要亮点包括： 1. 验证了SH-SY5Y细胞中TLR7的基础表达和Resiquimod的刺激效应。 2. 详细揭示了Resiquimod通过激活NF-κB途径诱导CCL2的分子机制。 3. 实验数据支持Resiquimod作为中枢神经系统病毒感染中潜在免疫治疗剂的价值。

研究价值

本研究为理解TLR7在神经元中的功能提供了新的视角，并为开发针对神经病毒感染的免疫疗法奠定了基础。同时，研究还指出了未来在神经元和胶质细胞之间的TLR7刺激相互作用的研究方向，强调了充分探索非原发性神经元样细胞系反应的重要性。

该研究为神经科学和免疫学领域的进一步研究提供了重要的理论支持和实验基础。