大判型マイクロアレイを再利用してスケーラブルな空間トランスクリプトミクスを実現する新手法：Array-Seq技術の誕生

背景と研究の起源

近年、空間分子解析（spatiomolecular analyses）は、生物医学研究や臨床病理学にとって重要なツールとなっています。これは、組織内の細胞や分子の空間的な配置が、それらの機能や健康・病気における異常な変化にどのように影響を与えるかを研究できるからです。しかし、既存の空間トランスクリプトミクス（spatial transcriptomics, ST）技術は、複数の面で制約を抱えています。特に、装置の高額さ、操作の複雑さ、表面積の小ささ、大量のサンプル処理との非互換性、さらに一般的な組織学染色（H&E染色など）との非互換性が挙げられます。これらの欠点は技術の普及を妨げ、基礎研究や臨床分析のコストと難易度を増大させています。

初期の空間トランスクリプトミクス技術（たとえばVisiumプラットフォーム）は、空間的なバーコード（spatial barcode）をpoly-Aテールを捕捉するオリゴヌクレオチドプローブに結合させ、特定の組織領域のトランスクリプトームをシーケンスすることを実現しました。しかし、この方法の表面積の小ささと高コストが広範な応用の主な障害となっています。一方で、古典的なオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（oligonucleotide microarrays）は、成熟した高スループットな遺伝子発現解析ツールとして、一世を風靡しました。そのため、研究者たちはこれらの古典的なツールを再利用して、より効率的で低コストの空間トランスクリプトミクスプラットフォームを開発できるのではないかと仮定しました。この背景のもと、本研究チームは革新的な解決策となるArray-Seq技術を提案しました。

論文の出典と研究チーム

この論文は《Repurposing large-format microarrays for scalable spatial transcriptomics》と題され、Denis Cipurko、Tatsuki Ueda、Linghan Mei、およびNicolas Chevrierによって執筆されました。この研究は、主に米国シカゴ大学プリツカー分子工学部（Pritzker School of Molecular Engineering, University of Chicago）で行われました。この論文は2024年11月にNature Methods誌に掲載され、オンラインDOIは https://doi.org/10.1038/s41592-024-02501-5 です。

実験設計と研究の流れ

本論文において、研究チームはArray-Seq技術を提案しました。これは、古典的なオリゴヌクレオチドマイクロアレイを再利用して、空間トランスクリプトミクス研究に使用可能な高スループットプラットフォームを構築する技術です。その研究プロセスは以下の主要なステップに分けられます。

1. マイクロアレイを用いた空間バーコード捕捉プローブの構築

研究者たちは、各アレイスポットにユニークなバーコード配列（spatial barcode）と2つの共通アンカー配列（anchors）が含まれるカスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイを設計しました。これらのバーコードプローブは、噴墨型フォスホラミダイト化学（ink-jet phosphoramidite chemistry）を用いてガラススライド表面上に合成され、1枚のマイクロアレイには974,016個のスポットが配置され、それぞれのスポット直径は30µm、中心間隔は36.65µmとなります。総表面積は11.31 cm²に及びます。

その後、2段階の反応を通じて、マイクロアレイ上にmRNA捕捉プローブを組み立てました。第一段階では、オリゴ配列がアンカー配列と相補的にハイブリダイズし、第二段階ではDNAポリメラーゼ（Phusion DNAポリメラーゼなど）を使用してプライマー延長反応を行い、DNAリガーゼ（T4 DNAリガーゼ）で接続して完全な捕捉プローブを生成しました。最後に、洗浄工程で正確に接続されていないプローブを除去し、捕捉プローブの純度を75%以上確保しました。

2. サンプル処理と空間トランスクリプトミクス分析

研究者たちは、Array-Seqプラットフォームを使用してマウスおよび人間の組織サンプルの2次元および3次元空間トランスクリプトミクスデータを分析しました。組織切片はまず固定（冷却メタノールを使用）され、標準的なH&E（ヘマトキシリン・エオシン）染色を施して組織学的特徴を確認しました。その後、組織内のmRNAを空間的に捕捉し、逆転写によるcDNA合成を行い、空間バーコード、UMI（ユニーク分子識別子）、およびターゲット配列との関連付けを行いました。

続いて、定量的高スループットシーケンス（Illuminaプラットフォーム）とアルゴリズム分析（例えばSTARsoloやScanpyツールキット）を用いて対応する空間遺伝子発現マトリクスを生成し、細胞の分類、組織領域の区分、および空間的な遺伝子発現分析に利用しました。

3. 結果の検証と比較

実験データを通じて、Array-Seq技術の性能が検証され、既存のVisiumプラットフォームと包括的に比較されました。以下は、嗅球組織（main olfactory bulb, MOB）、腎臓、骨髄など複数のマウスサンプルで行われた結果です。

1. 高感度と分解能：マウス嗅球のArray-Seqでは、スポットごとに平均3582個のUMIが検出され、1971個の遺伝子が特定されました。このデータは、組織層の既知の特徴を正確に再現しました。
2. サンプルカバレッジの柔軟性：Array-Seqはスライド1枚で約200万から2000万個の細胞を捕捉可能であり、これは組織サンプルの種類や切片数に依存します。
3. 3次元分析能力：連続切片を利用して、腎臓の腎領域の3次元トランスクリプトーム区分を構築し、深度に応じた組織の空間的特徴の変化を捉えました。
4. クロスプラットフォーム比較：Visiumと比べ、Array-Seqプラットフォームは点密度が8.1倍で、総点数が216.8倍に増加し、表面積はその26.7倍になります。また、検出感度や特定マーカー遺伝子の空間的局在においても非常に優れた結果を示しました。

4. 実験の拡張と全身器官への応用

研究ではさらに、Array-Seqの多組織サンプルや全身器官への適用可能性を確認しました。例えば、人間の脾臓を解析した際には、約12 cm²の全体切片が750,640個のスポットをカバーし、白髄、赤髄などの既知の遺伝子発現パターンや細胞型の分布が検出されました。特に、免疫細胞により生成されるケモカイン（例：CXCL13とその受容体CXCR5）は、高度に特異的な空間的分布を示し、期待される結果と一致しました。

研究の結論と意義

Array-Seqプラットフォームは、古典的なマイクロアレイと次世代シーケンシングの利点を融合し、現在の空間トランスクリプトミクスメソッドが抱える高コスト、低スループット、および複雑さといった課題を革新的に解決しました。このメソッドの主な優位性は以下の通りです。

1. 効率的で拡張可能：Array-Seqは、大表面積のサンプルに対応可能で、1回の実験のコストをVisiumの20分の1以下（1 cm²あたり約314〜628ドル）に削減します。
2. 簡単かつ使用しやすい：特殊な装置を必要とせず、通常の顕微鏡用スライドの準備とH&E染色と互換性があります。
3. 科学と応用の価値：複雑な組織構造を解析するための高分解能データを提供し、基礎研究や臨床研究（例：疾患の空間的異質性の研究）に新たな方向性を開きます。
4. 画期的な技術の統合：マイクロアレイ技術を再利用することで、空間トランスクリプトミクスの潜在能力を全面的に引き出し、より多くの研究室がこの研究ツールを手頃に利用可能にします。

研究のハイライトと将来展望

この研究の最も重要なハイライトは以下の通りです： - 革新的な技術設計により、従来の装置を効率的に最先端研究ツールへと転換しました。 - 大表面積の多様なサンプル解析能力、および3次元サンプル研究での卓越したパフォーマンス。 - 商業プラットフォームと同等の感度と分解能を達成しつつ、大幅なコスト削減により大規模な研究プロジェクトの展開を可能にした点。

Array-Seqの現在の課題は、分解能（30µmのスポット直径）や固定サンプル組織（パラフィン包埋サンプルなど）の互換性にありますが、研究チームは点間距離設計の最適化やサンプル前処理能力の拡張などでこれらの課題を克服することを計画しています。将来的には、このプラットフォームは多モーダル解析技術（例：プロテオミクスとの連携解析）や自動化プロセスとの融合によって、その適用範囲をさらに広げていくことが期待されています。

Array-Seq技術は、基礎生物学研究に全く新しいツールを提供するとともに、精密医療や空間病理学分野にも重要な技術基盤を提供しています。