新型エンドサイトーシス阻害剤がHIV-1 Tatタンパク質の神経細胞への侵入をブロック

学術的背景

HIV-1（ヒト免疫不全ウイルス1型）感染は、免疫系の機能低下だけでなく、神経認知障害（HIV-associated neurocognitive disorders, HAND）とも密接に関連しています。抗レトロウイルス療法（combined antiretroviral therapy, cART）によりHIV感染者の生存率は大幅に改善しましたが、HIV-1は依然として感染者体内に持続し、約3分の1の患者に神経認知障害を引き起こします。HIV-1の神経毒性は主にウイルスタンパク質Tat（transactivation of transcription protein）と関連しており、Tatタンパク質は血液脳関門を通過して神経細胞に入り込み、酸化ストレス、DNA損傷、ミトコンドリア機能障害を引き起こし、最終的に神経細胞死を導きます。

エンドサイトーシス（endocytosis）はウイルスが細胞内に侵入する主要な経路の一つであり、HIV-1 Tatタンパク質もエンドサイトーシスを通じて細胞内に入ります。したがって、Tatタンパク質のエンドサイトーシス過程を遮断することは、その神経毒性を防ぐための効果的な戦略となる可能性があります。しかし、既存のエンドサイトーシス阻害剤には非特異的な効果や副作用があり、臨床応用が制限されています。この問題を解決するために、本研究では新型エンドサイトーシス阻害剤を開発し、Tatタンパク質のエンドサイトーシスに対する阻害効果を評価し、神経保護における潜在的な応用について探討しました。

論文の出典

本論文はポーランド、フランス、ウクライナの複数の研究機関の研究チームによって共同で行われました。主な著者にはOlga Klaudia Szewczyk-Roszczenko、Piotr Roszczenko、Anna Shmakovaらが含まれており、彼らはそれぞれMedical University of Białystok、Institut Gustave Roussy、Danylo Halytsky Lviv National Medical Universityなどの機関に所属しています。論文は2024年12月24日に『American Journal of Physiology-Cell Physiology』誌に初めて掲載され、DOIは10.1152/ajpcell.00723.2024です。

研究の流れ

1. エンドサイトーシス阻害剤の設計と合成

研究者たちは、2種類の新型エンドサイトーシス阻害剤LES-6631とLES-6633を設計・合成しました。これらの化合物はrhodanine（ローダニン）骨格に基づいており、Knoevenagel縮合反応によって目的の化合物が合成されました。水溶性を向上させるために、さらにメタンスルホン酸塩形式に変換されました。合成プロセスでは、核磁気共鳴（NMR）および液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）などの技術を使用して化合物を特性評価しました。

2. 細胞培養と分化

モデル細胞としてヒト神経芽腫細胞株SH-SY5Yを使用しました。神経細胞の分化状態を模倣するために、研究者たちはSH-SY5Y細胞をレチノイン酸（retinoic acid）およびB-27サプリメントを含む培地で10日間培養しました。細胞の分化状態はKi-67抗体およびファロイジン（phalloidin）染色によって評価されました。

3. 細胞毒性の評価

LES-6631およびLES-6633の細胞毒性を評価するために、研究者たちは複数の細胞株（乳がん細胞MDA-MB-231、MCF-7、神経芽腫SH-SY5Yなど）でMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物）実験を行いました。その結果、これら2つの化合物はテスト濃度において低い細胞毒性を示し、IC50値はすべて30 μM以上でした。

4. エンドサイトーシス阻害実験

研究者たちは蛍光標識されたデキストラン（dextran）およびTat-Cy5複合体を使用して、LES-6631およびLES-6633のエンドサイトーシスに対する阻害効果を評価しました。細胞を1時間前処理した後、蛍光標識されたTat-Cy5またはデキストランを加え、その後固定して顕微鏡観察を行いました。その結果、LES-6631およびLES-6633は低濃度でエンドサイトーシスを有意に抑制し、古典的なエンドサイトーシス阻害剤であるクロルプロマジン（chlorpromazine）よりも優れた効果を示しました。

5. 酸化ストレスとDNA損傷の評価

LES-6631およびLES-6633がTatタンパク質によって誘発される酸化ストレスおよびDNA損傷に対する保護効果を調べるために、研究者たちは活性酸素（ROS）検出およびアルカリコメットアッセイ（alkaline comet assay）を行いました。その結果、これらの化合物を前処理することで、Tatタンパク質によって誘発される酸化ストレスおよびDNA損傷を有意に減少させることができることがわかりました。

6. グルタチオン（GSH）および一酸化窒素（NO）レベルの測定

研究者たちはさらに、LES-6631およびLES-6633が細胞内のグルタチオン（GSH）および一酸化窒素（NO）レベルに与える影響を評価しました。その結果、これらの化合物は細胞内のGSHレベルを有意に増加させ、NO生成を減少させることがわかり、酸化ストレスおよび硝化ストレスの軽減において顕著な効果があることを示しました。

主な結果

1. エンドサイトーシス阻害効果：LES-6631およびLES-6633は低濃度でTat-Cy5およびデキストランのエンドサイトーシスを有意に抑制し、クロルプロマジンよりも優れた効果を示しました。
2. 酸化ストレスからの保護：これらの化合物はTatタンパク質によって誘発される酸化ストレスを有意に減少させ、細胞内のROSレベルを正常に戻すことができました。
3. DNA損傷からの保護：コメットアッセイによって、LES-6631およびLES-6633がTatタンパク質によって誘発されるDNA切断を有意に減少させることができることがわかりました。
4. GSHおよびNOレベルの調整：これらの化合物は細胞内のGSHレベルを有意に増加させ、NO生成を減少させ、酸化ストレスおよび硝化ストレスの軽減において顕著な効果があることを示しました。

結論と意義

本研究では、2種類の新型エンドサイトーシス阻害剤LES-6631およびLES-6633を成功裏に開発し、これらは低濃度でHIV-1 Tatタンパク質のエンドサイトーシスを効果的にブロックし、Tatタンパク質によって誘発される酸化ストレス、DNA損傷、硝化ストレスを有意に軽減することがわかりました。これらの化合物は低い細胞毒性を持ち、神経保護において顕著な効果を示しており、HIV関連の神経変性疾患治療における潜在的な応用価値があることを示しています。

研究のハイライト

1. 新型エンドサイトーシス阻害剤：LES-6631およびLES-6633はrhodanine骨格に基づく新規化合物であり、高いエンドサイトーシス阻害効果を持っています。
2. 多面的な保護効果：これらの化合物はTatタンパク質のエンドサイトーシスをブロックするだけでなく、酸化ストレス、DNA損傷、硝化ストレスを軽減し、多重の保護効果を持っています。
3. 低い細胞毒性：複数の細胞株において、LES-6631およびLES-6633は低い細胞毒性を示し、良好な安全性を持つことを示しています。
4. 潜在的な臨床応用：これらの化合物は神経保護において顕著な効果を示しており、HIV関連の神経変性疾患治療における応用の理論的根拠を提供しています。

その他の貴重な情報

本研究の実験データは合理的な要請により提供されており、関連する補足資料はDOI 10.5281/zenodo.14287922から入手できます。本研究はMedical University of Białystok、National Research Foundation of Ukraineなどの機関から資金提供を受けました。