臨床的に誘導された培養方法を使用して、造血幹/前駆細胞から同種異系CAR-NKT細胞を生成する

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同種異系CAR-NKT細胞 造血幹細胞 免疫療法 臨床培養方法 腫瘍微小環境

臨床応用に向けたCAR-NKT細胞の生成に関する探討

研究背景

キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法は、FDA（食品医薬品局）によってB細胞悪性腫瘍や多発性骨髄腫の治療のために承認されています。しかし、自家CAR-T細胞製品の使用には、高コスト、製造時間の長さ、患者からの入手の難しさといった問題があります。特に、病状が進行している患者や前治療を受けた患者においては、CAR-T細胞の製造に用いるのに十分なT細胞が得られない場合があります。「オフザシェルフ（即時利用可能）」な細胞治療製品の開発に向けて、二つのアプローチが探求されています。一つは、移植片対宿主病（GVHD）のリスクを減少させるために内因性TCRの発現を削除した通常のαβT細胞を使用する方法であり、もう一つは、元々GVHDリスクの低い細胞タイプ（マクロファージ、NK細胞、ならびに不変ナチュラルキラーT（iNKTまたはNKT）細胞）を使用する方法です。

NKT細胞は、特定のαβT細胞の一種であり、不変なTCRα鎖とNKマーカーが共同発現していることが特徴です。これらの細胞は非多型性CD1d分子を認識するため、通常のT細胞のようにGVHDを引き起こしません。NKT細胞は強力な腫瘍殺傷活性、腫瘍への浸透能力、先天性および適応免疫応答を繋ぐ能力を持っており、「オフザシェルフ」な細胞療法としての発展の可能性を示しています。しかし、人血NKT細胞の希少性および末梢血単核細胞（PBMCs）からの拡張の難しさがNKT細胞療法の発展を制限しています。このため、他の供給源から異体NKT細胞の臨床利用に適応した生成方法を特定することが意義深いと考えられます。

研究出典

この研究は、Yan-Ruide Li、Yang Zhou、Jiaji Yuなど多くの研究者により共同で執筆され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（University of California, Los Angeles）など複数の機関に所属しています。研究は2023年8月23日に提出され、2024年3月28日に受理され、オンラインで「Nature Biotechnology」誌に発表される予定です。

研究プロセス

プロセスの詳細

  1. 研究デザイン：

    • 商業的に提供される凍結された人間の臍帯血由来のCD34+造血幹/前駆細胞（HSPCs）を取得し、NKT細胞を生成する。
    • 第0段階：CD34+ HSPCsを解凍し、ウイルスベクターを用いてCARおよび他の興味のある遺伝子をトランスダクトする。
    • 無供給、無血清の環境で全体の培養を行い、臨床要件に適合するようにする。

  2. 細胞生成プロセス：

    • 第1段階：HSPCsの拡張（2週間）。
    • 第2段階：NKT細胞への分化（1週間）。
    • 第3段階：NKT細胞のさらなる分化（1週間）。
    • 第4段階：NKT細胞の拡張（2週間）。

  3. 実験詳細およびサンプル処理：

    • NKT細胞拡張段階で2つの代替戦略をテストし、臨床開発の可能性を評価するためにα-ガラクトシルセラミド（αGC）をロードした健康なドナーPBMCsまたはK562ベースの人工抗原提示細胞（AAPCs）を使用。
    • 分化したNKT細胞はフローサイトメトリーによって細胞の表現型および機能を特定する。

  4. 主要実験：

    • 多発性骨髄腫（MM）モデルで生成された異体CAR-NKT（alloCAR-NKT）細胞の抗腫瘍効果、拡張性および持続性をテスト。
    • 脾臓、骨髄および末梢血においてフローサイトメトリーおよび1細胞TCRシーケンシングを実施し、NKT TCRの均一性表現および他の腫瘍抗原の組み合わせを検証。

  5. データ分析：

    • 1細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）を使用して遺伝子解析を行い、異なる段階および治療細胞の遺伝子発現プロファイルを評価。
    • 遺伝子発現、表現型解析および機能テストのデータを統合し、抗腫瘍環境におけるalloCAR-NKT細胞の性能およびメカニズムを明らかにする。

実験結果

  1. 細胞生成および拡張：

    • 生成されたalloCAR-NKT細胞は収量および純度において高い一貫性を示し、入力されたCD34+ HSPCsから出力された成熟したalloCAR-NKT細胞への100万倍以上の拡張を実現。

  2. 表現型および機能：

    • alloCAR-NKT細胞はフローサイトメトリーにおいて典型的なNKT細胞の表現型を示す。
    • in vitro実験でallo/15bCAR-NKT（IL-15増強を含む）細胞は強力な免疫機能を示し、高レベルのエフェクターサイトカインおよび細胞毒性分子を持つ。
    • ELISAおよび免疫蛍光分析により、多標的メカニズム（CAR、TCRおよびNK受容体）を介した腫瘍細胞の殺傷を含むこれらの細胞による抗腫瘍効果を確認。

  3. 抗腫瘍効果：

    • 複数の一次多発性骨髄腫サンプルにおいて、allo/15bCAR-NKT細胞は顕著な腫瘍細胞殺傷能力を示す。
    • ヒトMM異種移植マウスモデルでは、単回投与のallo/15bCAR-NKT細胞により腫瘍が除去され、長期の動物生存を実現。

  4. 腫瘍環境および免疫逃避：

    • allo/15bCAR-NKT細胞は腫瘍微小環境（TME）内の免疫抑制細胞の選択的除去効果を示す。
    • 効果的な腫瘍殺傷を行いつつ、GVHDやサイトカイン放出症候群（CRS）を顕著に引き起こさない。

研究結論

生成されたalloCAR-NKT細胞はプロセス、性能および安全性の面で卓越した特性を示し、以下を含む： - 高純度・高一貫性の細胞生成。 - 多標的の抗腫瘍能力および優れた細胞生存およびエフェクター機能。 - 一定条件下でGVHDおよびCRSを引き起こさず、臨床応用の潜在性の高さを示す。

研究意義

この研究は、臨床ガイドラインに基づく細胞培養法を最適化することで、高効率な異体CAR-NKT細胞の成功裏に生成が可能であることを示し、三次元培養や異種フィーダー条件に依存しない広範な応用の可能性を実現した。この成果は、さまざまな血液癌や固形腫瘍の細胞療法に新たな可能性を提供し、他の疾患の治療にも拡大する可能性があります。