TCR刺激和Pifithrin-A调节提高CRISPR工程化人类T细胞的基因组安全性
CRISPR-Cas9基因编辑技术在癌症治疗中的应用，尤其是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的开发，已经取得了显著的进展。然而，CRISPR编辑过程中可能引发的染色体异常，如大片段缺失、染色体易位和非整倍体，成为了临床应用中的一大隐患。尽管已有研究通过优化CRISPR-Cas9系统的组件来减少这些风险，但T细胞内在的特性，如T细胞受体（TCR）激活后的快速扩增，对基因组安全性的影响尚未得到充分研究。因此，Laurenz T. Ursch等人开展了这项研究，旨在探讨TCR激活和细胞增殖对CRISPR编辑结果的影响，并寻找提高CRISPR工程化T细胞基因组安全性的策略。
论文来源
该论文由Laurenz T. Ursch、Jule S. Müschen、Julia Ritter等作者共同撰写，作者来自德国慕尼黑工业大学（Technical University of Munich）、弗莱堡大学医学中心（University of Freiburg Medical Center）等机构。论文于2024年12月17日发表在《Cell Reports Medicine》期刊上，题为“Modulation of TCR Stimulation and Pifithrin-α Improves the Genomic Safety Profile of CRISPR-Engineered Human T Cells”。
研究流程与结果
研究流程
T细胞激活与CRISPR编辑结果的关系
研究首先比较了未激活和激活的CD4 T细胞在CRISPR编辑后的结果。通过靶向安全港基因AAVS1、表面受体CD4和激活依赖性受体PD-1，研究人员使用Cas9核糖核蛋白（Cas9 RNPs）进行编辑。编辑后，T细胞被分为未激活组和通过抗CD3/CD28抗体激活组。4天后，通过流式细胞术检测CD4和PD-1的蛋白表达水平，并通过下一代测序（NGS）分析AAVS1的编辑效率。结果显示，激活的T细胞在CD4和PD-1位点的敲除效率更高，但同时也伴随着更大的缺失片段。T细胞增殖速度与缺失片段大小的关系
研究人员进一步探讨了T细胞增殖速度对CRISPR编辑结果的影响。通过使用CFSE染料标记CD4 T细胞，并根据CFSE稀释模式将细胞分为快速增殖和缓慢增殖组。结果显示，快速增殖的T细胞在编辑后产生了更大的缺失片段，而缓慢增殖的细胞则表现出更小的缺失。Pifithrin-α对CRISPR编辑结果的影响
研究人员测试了两种p53抑制剂——Pifithrin-α（PFT-α）和Pifithrin-m（PFT-m）对CRISPR编辑结果的影响。结果显示，PFT-α在激活的T细胞中减少了缺失片段的大小，而PFT-m则略微增加了缺失片段。进一步的研究表明，PFT-α的作用不依赖于p53，并且能够维持CRISPR工程化T细胞的功能。PFT-α对T细胞功能的影响
为了评估PFT-α在临床应用中的潜力，研究人员检测了PFT-α处理后的T细胞在体外和体内的功能。结果显示，PFT-α处理后的T细胞在细胞因子分泌、T细胞亚群组成和肿瘤细胞杀伤能力方面与对照组无显著差异。PFT-α对染色体异常和非整倍体的影响
通过单靶向连接介导的PCR测序（CAST-seq）和单细胞核型测序（scKaryo-seq），研究人员发现，PFT-α能够显著减少CRISPR编辑引发的染色体易位和非整倍体。
主要结果
T细胞激活与缺失片段大小的关系
激活的T细胞在CRISPR编辑后产生了更大的缺失片段，而未激活的T细胞则表现出更小的缺失。T细胞增殖速度与缺失片段大小的关系
快速增殖的T细胞在编辑后产生了更大的缺失片段，而缓慢增殖的细胞则表现出更小的缺失。PFT-α对缺失片段大小的影响
PFT-α在激活的T细胞中减少了缺失片段的大小，并且这一作用不依赖于p53。PFT-α对T细胞功能的影响
PFT-α处理后的T细胞在细胞因子分泌、T细胞亚群组成和肿瘤细胞杀伤能力方面与对照组无显著差异。PFT-α对染色体异常和非整倍体的影响
PFT-α能够显著减少CRISPR编辑引发的染色体易位和非整倍体。
结论与意义
该研究表明，TCR激活和细胞增殖是CRISPR编辑过程中染色体异常的重要驱动因素。通过控制T细胞激活和添加PFT-α，可以显著提高CRISPR工程化T细胞的基因组安全性。PFT-α不仅减少了缺失片段的大小，还维持了T细胞的功能，为CRISPR工程化T细胞的临床应用提供了新的策略。
研究亮点
重要发现
TCR激活和细胞增殖是CRISPR编辑过程中染色体异常的重要驱动因素，PFT-α能够在不影响T细胞功能的情况下减少这些异常。方法创新
研究首次系统性地探讨了T细胞激活和增殖对CRISPR编辑结果的影响，并提出了通过控制T细胞激活和添加PFT-α来提高基因组安全性的策略。应用价值
该研究为CRISPR工程化T细胞的临床应用提供了新的安全性保障，具有重要的科学和应用价值。
其他有价值的信息
该研究还探讨了PFT-α在不同T细胞亚群中的特异性效应，并发现PFT-α在T细胞亚群中的效果存在差异。此外，研究还通过体外和体内实验验证了PFT-α处理后的T细胞在肿瘤治疗中的有效性。