エンドセリン受容体における拮抗選択性の構造的基盤

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内皮素受容体の拮抗剤選択性の解明：冷凍電子顕微鏡を用いた研究が重要な分子メカニズムを明らかに

学術背景

内皮素（Endothelin, ET）は強力な血管収縮ペプチドであり、心血管機能の調節において重要な役割を果たします。このファミリーにはET-1、ET-2、ET-3が含まれ、これらは内皮素受容体（Endothelin Receptors, ETRs）と結合することで血管の緊張や全体的な心血管の恒常性を調整します。内皮素受容体は主にETAとETBの2つのサブタイプがあり、これらは63％の配列相同性を有するものの、リガンドの親和性や機能において顕著な違いを示します。具体的には、ETAはET-1とET-2に高い親和性を持ち強力な血管収縮を誘導するのに対し、ETBは3つの内皮素アイソフォーム全てに等しい親和性を持ち、一酸化窒素の放出を通じて主に血管拡張を引き起こし、さらにET-1の除去を促進します。

ETRは多くの心血管疾患において重要な役割を果たしており、特に肺動脈性肺高血圧症（Pulmonary Arterial Hypertension, PAH）の治療において重要な治療標的とされています。現在、ETA拮抗剤（Macitentan、Ambrisentanなど）やETA/ETB二重拮抗剤（Bosentanなど）は臨床応用が認められています。しかし、ETB受容体に対する結合および活性化メカニズムに関する広範な研究が行われている一方で、ETA拮抗剤の構造選択性については依然として理解が不足しており、選択的拮抗剤の設計の進展が制限されています。本研究は、これら未解決の問題に焦点を当て、ETAと主要拮抗剤の結合に関する分子メカニズムを初めて明らかにし、抗体によるETA活性調節の可能性も探索しました。

研究の出典

本論文は、復旦大学付属中山病院、上海科技大学iHuman研究所、生命科学技術学院など複数の機関による共同研究で、2024年に国際的に有名な学術誌『Cell Discovery』に発表されました。研究チームには、心臓集中治療、生命科学、技術研究分野からのJunyi Hou、Shenhui Liu、Xiaodan Zhangなど多数の研究者が参加しています。

研究設計とプロセス

1. 冷凍電子顕微鏡研究の革新的な戦略：
研究者は冷凍電子顕微鏡（Cryo-EM）技術を用いて、ETAと3つの拮抗剤（Macitentan、Ambrisentan、Zibotentan）の複合体構造を解析しました。さらに、静止状態のGタンパク質共役受容体（GPCRs）の構造解析の課題を解決するために、チームは最適化された戦略を設計し、ETAの細胞内ループに熱安定化Brilタンパク質を導入して複合体の安定性を高めるとともに、ETA専用抗体Fab301を導入し、冷凍電子顕微鏡データの質を著しく向上させました。

2. 抗体Fab301の役割：
Fab301は、ETA複合体の安定化を通じて構造解析を促進するだけでなく、ET-1によって誘発されるETAシグナルに対して拮抗作用を示しました。Fab301を結合したETAの複合体構造の分解能はそれぞれ3.1から3.2 Åに達しました。

3. 実験プロセス：
研究では以下の重要なステップが設計されました： - 冷凍電子顕微鏡を使用して3つの拮抗剤（Macitentan、Ambrisentan、Zibotentan）とETAの結合に関する高分解能構造を解析しました。 - ETAおよびETB受容体がアゴニストおよび拮抗剤と結合した際の異なる構造的特徴を比較しました。 - 分子動力学シミュレーションと部位特異的変異実験を通じて、リガンド結合および選択性に対する重要なアミノ酸の影響をさらに検証しました。

主要な研究結果

1. ETAと拮抗剤の結合に関する分子メカニズム：
- Macitentan：
Macitentanは、ETA選択性の高い拮抗剤であり、双拮抗剤Bosentanの誘導体です。その重要なスルホンアミド基はR326、K166、K255などの残基と水素結合およびイオン相互作用を形成することで結合の安定性を大幅に向上させます。また、Macitentanのブロモフェニル基は受容体の疎水性コアに埋め込まれ、TM5およびTM6との間で複数の疎水相互作用を形成します。

  • Ambrisentan：
    Ambrisentanはカルボン酸誘導体で、分子量は小さいながらもETAに対して非常に高い親和性を示します。そのカルボキシル基はK166およびR326とイオン結合を形成し、さらにQ165と水素結合ネットワークを形成することで結合サイトにしっかりと嵌り込みます。加えて、ベンゼン環がTM3およびTM4の疎水性残基と密に接触し、結合の選択性を高めます。

  • Zibotentan：
    Zibotentanはスルホンアミド基を持つ拮抗剤で、ETAと結合すると独特の「椅子型」構造を取ります。そのスルホンアミド基はQ165、K166、R326と電気的な相互作用を形成し、ピリジン環はETAとの選択性に大きな影響を与える極性相互作用を行います。

2. ETA選択性に寄与する重要な残基：
ETAのF1613.28およびY1292.53残基は、緊密な結合ポケットを形成し、重要な相互作用ネットワークを構築する上で重要な役割を果たしています。一方で、ETBにおいては、これらの位置により小さいV1773.28およびH1502.53が置換されており、より大きな配位子（Bosentanなど）と結合することができます。

3. 抗体Fab301の作用メカニズム：
Fab301は、ETAの細胞外ループECL2の重要な残基（R232、G233など）と相互作用することで、ETAに対して選択的な拮抗作用を示します。Fab301の結合はET-1とETAの結合を阻止するだけでなく、ECL2の構造を変化させることで受容体の活性化を妨げます。

研究の意義

本研究は、冷凍電子顕微鏡による解析を通じて、ETA受容体拮抗剤の選択的結合の分子基盤を初めて明らかにしました。これらの発見は、選択性が高く、作用が強力なETA拮抗剤や抗体の開発に理論的な基盤を提供し、PAHやその他の心血管関連疾患の精密治療に重要な意義を持ちます。また、Fab301は新しいタイプの抗体として、受容体の選択的制御のためのテンプレートを提供し、抗体医薬品の開発に新たな道を開きました。

研究のハイライトと展望

  1. 分子メカニズムへの深い洞察：
    本研究は、ETA拮抗剤の結合ポケットにおける重要な残基の役割を明らかにし、分子シミュレーションと変異解析を組み合わせることで、これらの相互作用の生物学的な重要性を検証しました。

  2. 革新的な研究戦略：
    Fab301を使用して複合体の安定性を高め、冷凍電子顕微鏡の解析を支援する革新的な方法は、今後の研究にとって参考となります。

  3. 臨床応用の展望：
    研究結果は、PAH治療薬の最適設計に強力な構造的基盤を提供するとともに、抗体Fab301の応用は新たな薬物開発の方向性を示唆しています。

科学者たちは、GPCR構造と機能の関係に関する理解をさらに深めるとともに、心血管疾患の精密治療。