非人霊長類とヒトの網膜における高精度な塩基編集技術の応用

研究背景

スターガルト病は現在治療法がない遺伝性神経変性疾患で、主にABCA4遺伝子の機能喪失変異により黄斑変性や失明を引き起こします。ABCA4遺伝子がコードするタンパク質は、光受容体と網膜色素上皮細胞（RPE細胞）に局在する膜脂質フリッパーゼであり、視網膜内の有毒なレチノイドの蓄積を防ぐ役割を持ちます。スターガルト病で最も一般的な変異は、ABCA4遺伝子のc.5882G>A（p.Gly1961Glu）点変異で、この変異はタンパク質機能の喪失を引き起こし、疾患を誘発します。

これまでに、細胞株やマウスモデルでの塩基編集に関する研究はいくつかありますが、ヒトおよび非ヒト霊長類（NHPs）の神経組織において効率的な遺伝子編集を実現することは依然として課題です。本研究では、ABCA4遺伝子のc.5882G>A変異を修正するためのアデノ随伴ウイルス（AAV）ベースのアデニン塩基編集戦略を開発し、ヒトおよび非ヒト霊長類モデルにおけるその効率と精度を検証することを目指しました。

論文出典

本論文はAlissa Muller、Jack Sullivan、Wibke Schwarzerら複数の研究機関に所属する科学者たちが共同で執筆し、主著者はInstitute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel、Beam Therapeuticsなどの機関から参加しています。論文は2025年2月に『Nature Medicine』誌に掲載され、タイトルは「High-efficiency base editing in the retina in primates and human tissues」です。

研究プロセスと詳細な方法

1. 塩基編集戦略の設計と最適化

研究チームはまず、ABCA4遺伝子のc.5882G>A変異を修正するために、分割インテインアデニン塩基エディター（ABE）をコードする二重AAVベクターを設計しました。編集効率を最適化するために、研究チームはヒトモデル（網膜オルガノイド、人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来のRPE細胞、成人網膜外植片およびRPE/脈絡膜外植片）でABCA4塩基編集の最適化を行いました。

2. 体外モデルでの塩基編集の検証

研究チームは、ABCA4 c.5882G>A変異を持つHEK293T細胞株で異なる塩基エディターやガイドRNA（gRNA）をテストし、最も効率の高いgRNAをスクリーニングしました。その後、ヒト網膜オルガノイド、網膜外植片、およびRPE/脈絡膜外植片で塩基編集の効率を検証しました。結果として、in vitroモデルにおいてABCA4遺伝子の編集効率が高いことが示されました。

3. マウスモデルでの塩基編集の検証

研究チームはマウスモデルでAAV9-PHP.eBベクターをテストし、網膜下注射によって塩基エディターを網膜に送達しました。結果として、マウスの網膜およびRPE/脈絡膜組織において、ABCA4遺伝子の編集効率が高く、オフターゲット編集は検出されませんでした。

4. 非ヒト霊長類モデルでの塩基編集の検証

研究チームはさらに、非ヒト霊長類モデル（NHP）で塩基編集の効率を検証しました。網膜下注射によって、AAV5-SABE1ベクターをNHPの網膜に送達し、編集効率を評価しました。結果として、NHPの網膜およびRPE/脈絡膜組織において、ABCA4遺伝子の編集効率が高く、特に錐体細胞とRPE細胞で顕著な編集効果が示されました。

5. 塩基エディターの最適化と用量効果

研究チームはさらに、AAVベクターのパッケージ効率を最適化し、NHPで異なる用量のAAV5-SABE1ベクターの編集効率をテストしました。結果として、最適化されたAAV5-V2-SABE1ベクターは低用量でも効率的な遺伝子編集を実現し、錐体細胞およびRPE細胞での編集効率が大幅に向上しました。

主要な研究結果

1. in vitroモデルでの高効率な塩基編集：ヒト網膜オルガノイド、網膜外植片、およびRPE/脈絡膜外植片において、ABCA4遺伝子の編集効率が高く、オフターゲット編集は検出されませんでした。
2. マウスモデルでの高効率な塩基編集：マウスの網膜およびRPE/脈絡膜組織において、ABCA4遺伝子の編集効率が高く、オフターゲット編集は検出されませんでした。
3. 非ヒト霊長類モデルでの高効率な塩基編集：NHPの網膜およびRPE/脈絡膜組織において、ABCA4遺伝子の編集効率が高く、特に錐体細胞およびRPE細胞で顕著な編集効果が示されました。
4. 塩基エディターの最適化と用量効果：最適化されたAAV5-V2-SABE1ベクターは低用量でも効率的な遺伝子編集を実現し、錐体細胞およびRPE細胞での編集効率が大幅に向上しました。

研究結論と意義

本研究は、ヒトおよび非ヒト霊長類の網膜において高効率かつ高精度な塩基編集を実現できることを示し、スターガルト病の遺伝子治療に新しい戦略を提供しました。研究結果によると、AAVベースのアデニン塩基編集技術はABCA4遺伝子のc.5882G>A変異を効率的に修正でき、錐体細胞およびRPE細胞で顕著な編集効果を示しました。さらに、研究チームはAAVベクターのパッケージ効率を最適化することで、塩基編集の効率を向上させ、必要なベクター用量を削減しました。

研究のハイライト

1. 高効率な塩基編集：本研究はヒトおよび非ヒト霊長類の網膜において高効率な塩基編集を実現し、スターガルト病の遺伝子治療に新しい戦略を提供しました。
2. 高精度：研究結果は、標的部位において塩基編集が非常に正確であり、オフターゲット編集は検出されなかったことを示しました。
3. AAVベクターの最適化：AAVベクターのパッケージ効率を最適化することで、研究チームは塩基編集の効率を向上させ、必要なベクター用量を削減しました。
4. 非ヒト霊長類モデルでの検証：非ヒト霊長類モデルで塩基編集の効率を検証し、臨床試験に重要な参考情報を提供しました。

その他の貴重な情報

研究チームはさらに全ゲノムスクリーニングを通じて塩基編集のオフターゲット効果を分析し、ヒト外植片ではオフターゲット編集が検出されなかったことを示し、塩基編集の高精度性をさらに証明しました。また、研究チームは網膜以外の他の組織での塩基編集効率も評価し、編集は網膜およびRPE/脈絡膜組織に限定されていることが示されました。

本研究の成功は、他の標的可能な塩基編集による遺伝性網膜疾患の治療に重要な参考を提供し、塩基編集技術が遺伝性疾患治療における大きな可能性を持っていることを示しました。