AIFM1遺伝子のミスセンス変異による、ミトコンドリア機能障害とリボフラビン欠乏不耐性

研究背景

ミトコンドリアは二重膜構造を持つ細胞小器官で、有核真核細胞に存在し、主に酸化的リン酸化によってアデノシン三リン酸(ATP)を産生し、細胞にエネルギーを供給しています。ミトコンドリアは独自のゲノムを持ち、ミトコンドリア呼吸鎖複合体に関与する13種類のタンパク質をコードしていますが、その他のミトコンドリアタンパク質は核ゲノムによってコードされ、ミトコンドリアに輸送されます。その中で、アポトーシス誘導因子(Apoptosis-Inducing Factor, AIFM1)はX連鎖AIFM1遺伝子によってコードされるミトコンドリアフラビンタンパク質で、カスパーゼ非依存性細胞死に関与し、呼吸鎖複合体の生合成を調節します。

研究によると、AIFM1遺伝子の変異は様々な臨床表現型と関連していますが、リボフラビン(ビタミンB2)治療の効果については未だ議論があります。本研究は、AIFM1遺伝子のc.1019T > C変異がミトコンドリア機能障害を引き起こすメカニズムを探索し、この変異に対するリボフラビン補充の影響を評価することを目的としています。

研究出典

この研究は、山東大学斉魯病院神経筋および神経変性疾患研究所、山東大学斉魯病院(青島)ミトコンドリア医学研究室、山東大学脳科学研究所、山東中医薬大学附属病院などの機関の研究者によって共同で行われました。主な著者にはZhao Ying、Lin Yan、Wang Bin、Liu Fuchenなどが含まれています。研究成果は2023年5月23日に受理され、2023年8月9日に受理され、2023年8月21日に「Neuromolecular Medicine」にオンラインで発表されました。

研究方法とプロセス

実験対象

研究対象は、歩行異常で入院した7歳の男児で、小脳性運動失調、軸索性感覚運動ニューロパチー、筋力低下の臨床症状を呈し、家族歴に顕著な異常はありませんでした。倫理委員会の承認後、男児とその両親の全ゲノムDNA配列解析と組織学的分析を行いました。

ゲノムとアミノ酸解析

末梢血から総ゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンシング(NGS)を用いて神経疾患ゲノム検査を行い、Sangerシーケンシングで変異を確認し、家族内検証を行いました。アミノ酸保存性解析はMutationTasterを使用して行いました。

筋組織学と免疫組織化学研究

患者の上腕二頭筋生検を行い、8μm厚の凍結切片に対して、ヘマトキシリン-エオジン染色(HE)、改変Gomori三色染色(MGT)、細胞質C酸化酵素(COX)染色などの一連の組織化学および免疫組織化学染色を行いました。さらに、筋肉切片にAIFM1抗体(17984-1-AP, Proteintech)による免疫組織化学染色を行いました。

線維芽細胞培養

皮膚生検から初代皮膚線維芽細胞を得て、標準的な方法で培養しました。線維芽細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM培地で培養しました。リボフラビン欠乏研究では、リボフラビンを含まないカスタムDMEM培地を使用しました。リボフラビン補充研究では、異なる濃度のリボフラビン溶液を等量添加しました。

ウェスタンブロッティング

筋肉サンプルと皮膚線維芽細胞を溶解し、タンパク質定量を行いました。各サンプルに30μgのタンパク質を負荷し、12%変性SDS-PAGEで電気泳動した後、PVDF膜に転写し、AIFM1、全酸化的リン酸化抗体カクテル(OXPHOS Antibody Cocktail)、および他のミトコンドリア呼吸鎖複合体サブユニットに対する主要抗体を用いてブロッティング解析を行いました。

酸素消費率測定

Seahorse Bioscience XFe24アナライザーを用いて線維芽細胞の酸素消費率を測定し、異なる阻害剤や脱共役剤を添加後、ATP産生、最大呼吸、非ミトコンドリア呼吸などを測定しました。

ミトコンドリア膜電位測定

ミトコンドリア特異的染料JC-1を用いてミトコンドリア膜電位(Δψm)を検出し、蛍光顕微鏡下で観察し定量分析しました。

アポトーシス測定

Tunel染色法を用いて線維芽細胞のアポトーシスレベルを測定し、488nm励起と530nm発光でTunelラベルされた細胞を観察し、Staurosporine処理後にアポトーシス誘導を行いました。

統計分析

SPSS 24.0ソフトウェアとGraphPad Prism 8を用いて統計分析を行いました。定量データは平均値±標準偏差で表し、データは片側Student’s t検定で分析し、p値が0.05未満を統計的に有意とみなしました。

研究結果

AIFM1遺伝子変異の同定

ゲノムDNA配列解析により、患者のAIFM1遺伝子にc.1019T > Cミスセンス変異が存在することが示されました。アミノ酸保存性解析では、この部位の配列が複数の種で高度に保存されており、変異によりアミノ酸がメチオニンからスレオニンに変化することがわかりました(p. Met340Thr)。米国医学遺伝学・ゲノム学会(ACMG)のガイドラインに基づき、この変異は「おそらく病原性」変異に分類されました。

ミトコンドリア異常

患者の上腕二頭筋生検では筋線維の大きさが不均一で、MGT染色では少量の赤色細胞膜下斑状領域が見られ、ミトコンドリアの異常集積を示唆しました。COX染色では少量のCOX減少線維が見られ、SDH/COX二重染色で見られた異常な青色線維がミトコンドリア異常の存在を証明しました。ATPase染色では軽度の再神経支配現象が見られました。

AIFM1とミトコンドリア複合体サブユニットの発現量低下

免疫組織化学染色とウェスタンブロット結果から、患者の筋組織と皮膚線維芽細胞でAIFM1の発現量が著しく低下していることがわかりました。同時に、筋組織ではI型複合体のNDUFB8サブユニットとIII型複合体のCYTBサブユニットの発現が著しく低下していました。

ミトコンドリア呼吸機能障害

Seahorseアナライザーによる測定では、患者の線維芽細胞の基礎呼吸、ATP産生、プロトンリーク、最大呼吸、予備呼吸能力がいずれも著しく低下していました。複合体I、II、IVが介在する呼吸は変異細胞で著しく減少していました。

リボフラビン欠乏によるAIFM1の下方制御

リボフラビン欠乏条件下で、変異体と野生型の線維芽細胞のAIFM1レベルが徐々に低下し、変異体細胞でより顕著な低下が見られました。高濃度のリボフラビン(2および20mg/L)はAIFM1レベルを部分的に増加させることができました。

臨床症状の改善

患者に1日100mgのリボフラビン治療を10ヶ月間行った後、運動失調と筋力低下に著明な改善が見られ、国際運動失調評価尺度(ICARS)スコアが19%改善しました。

結論

本研究は、AIFM1遺伝子のc.1019T > C変異の病原性を検証し、ミトコンドリア機能障害を引き起こし、この変異を持つ細胞がリボフラビン欠乏に対して不耐性であることを示しました。リボフラビン補充はAIFM1タンパク質レベルとミトコンドリア呼吸機能の維持に有効です。早期のリボフラビン治療はAIFM1変異患者に一定の治療価値がある可能性があります。

研究の意義

本研究は、AIFM1遺伝子変異によるミトコンドリア疾患に新たな科学的証拠を提供し、早期リボフラビン治療の重要性を強調し、将来の臨床治療に参考を提供しました。