脳虚血損傷においてp39がミエリン形成に与える影響
p39の脳虚血障害における役割
背景紹介
脳卒中（stroke）は極めて深刻な公衆衛生問題であり、現在の研究は主に損傷メカニズムの研究と新たな標的の特定に集中しています。p39はCDK5（Cyclin-dependent kinase 5）の活性化因子として、様々な疾患で重要な役割を果たしています。本論文では、p39の脳虚血障害における役割とそのメカニズムを主に研究しました。研究により、p39のレベルが脳虚血-再灌流（I/R）障害後の異なる時期に著しく低下することが分かりました。さらなる研究から、p39の欠損は短期的には脳に神経保護効果をもたらすが、I/R修復段階では行動機能障害を悪化させることが示されました。これは、より高いレベルのp35が誘導する脱髄作用によるものかもしれません。
論文情報
本論文はDanyang Meng、Di Wu、Xiaojing Li、Zhigang Miaoによって執筆されました。著者らはそれぞれ蘇州大学附属第二病院、蘇州病院、南京大学医学院附属病院、南京金陵病院に所属しています。この論文は「Neuromolecular Medicine」誌に掲載され、巻号は26:22、DOIはhttps://doi.org/10.1007/s12017-024-08792-3で、2024年4月22日に受理され、2024年5月20日に受理されました。
研究プロセス
実験動物
8-10週齢の雄性C57/B6マウスを使用し、p39野生型（p39wt）と欠損型（p39ko）に分けました。すべての動物実験手順は蘇州大学動物care委員会の承認を得ています。
脳中動脈閉塞モデル（MCAO）
Xuらが2006年に記述した方法を参考に、6-0単糸を血管に挿入し、45分後に再灌流を行いました。手術中はマウスの体温を36.5-37.5°Cに保ち、成功率は80%に達しました。
TTC染色
MCAO 24時間後、大脳組織を切り取り、0.2%の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色し、AlphaEase画像解析ソフトウェアを用いて分析しました。
行動テスト
握力テスト、ロータロッドテスト、ホットプレートテスト、高架式十字迷路を含み、それぞれMCAO前、再灌流24時間後、3日、7日、14日後に実施しました。握力、回転時間、ホットプレート上での反応時間、高架式十字迷路への進入時間をテストしました。
免疫組織化学分析
再灌流14日後、マウスを麻酔し、4%パラホルムアルデヒドで心臓内灌流固定を行い、15μm厚の切片に切断しました。抗p35/25抗体と抗MBP抗体を用いて免疫蛍光二次抗体インキュベーションを行い、蛍光顕微鏡で顕微鏡写真を撮影しました。
Western BlotとリアルタイムPCR（qPCR）
Western Blotを用いて異なる時点（6時間、12時間、24時間、3日、7日、14日）でのp39レベルを検出し、qPCRを用いてmRNAレベルを検出しました。SDS-PAGEとPVDF膜転写を電気泳動分析に使用し、Alpha Ease画像解析ソフトウェアで定量化しました。
統計分析
GraphPad Prismソフトウェアを用いてデータ分析を行い、Student’s t検定を用いて2群間の差異を比較し、有意水準はp < 0.05に設定しました。
研究結果
虚血障害後のp39レベルの低下
Western Blotにより、p39が虚血障害後の異なる時点で著しく低下し、24時間で最低点に達し、7日で正常に回復することが分かりました。定量分析結果はqPCR結果と一致していました。
p39欠損による虚血障害後の梗塞体積の減少
行動テストにより、p39koマウスがMCAOモデル作成前の各テストで正常に機能していることが分かりました。24時間後のTTC染色結果は、p39koマウスの梗塞体積が著しく減少し、神経機能スコアが著しく低下し、体重がp39wtマウスよりも著しく高く、3日間の生存率が高いことを示しました。
p39欠損の虚血障害後の持続的回復への悪影響
虚血障害後7日目と14日目の行動機能測定で、p39koマウスの握力時間、足跡エラー数、前肢の非対称性が著しく増加し、p39欠損が神経機能の長期回復に影響を与えることが示されました。
p39欠損が修復メカニズムに影響を与える潜在的メカニズム
p35レベルの検出により、p39koマウスで損傷後14日目にp35が著しく増加したが、損傷前と1日目には明らかな変化がないことが分かりました。免疫組織化学と蛍光検出により、p35の増加とミエリン産生の減少が確認され、p39欠損が脱髄作用と修復効果の低下をもたらすことが示されました。
結論と示唆
本研究では、p39が虚血再灌流障害後に著しく低下し、p39の欠損が短期的には脳梗塞体積を減少させ神経機能の回復を促進するが、長期的には神経機能障害をもたらすことが分かりました。これは主にミエリンの脱落によるものです。これらの発見は、将来の脳虚血障害の薬物開発に新たな理論的基礎を提供しています。
研究のハイライト
- 研究の革新性：p39の脳虚血障害における役割とそのメカニズムを初めて深く研究しました。
- 方法の多様性：多様な行動テスト、免疫組織化学、Western Blot、qPCRなど、多くの実験方法を組み合わせました。
- 理論的基礎：新しい脳虚血障害メカニズムの発見と将来の治療薬開発のための堅固な理論的基礎を提供しました。
その他の重要情報
本研究は蘇州医学研究院基礎フロンティア革新交差プロジェクト（YXY2304057）と嘉興市科学技術プロジェクト（2021AY30022）の支援を受けています。著者らは、p39が脳虚血障害修復の重要な標的である可能性があり、将来的にはp39レベルの調節を通じて新しい治療薬を開発できる可能性があると考えています。