中枢神経系免疫の活性化：Resiquimodメカニズムに関する研究

神経内科学 リウマチおよび免疫学 医学 生命科学 免疫学
Resiquimod TLR7 中枢神経系 免疫応答 神経細胞 炎症性ケモカイン NF-κB

TLR7は神経細胞においてNF-κBを介してCCL2の発現を誘導する

研究背景

Toll様受容体（Toll-like receptors, TLRs）は微生物の特定の分子構造を認識する重要なメカニズムの一つです。ヒトでは、10種類のTLRs（TLR1-10）が知られており、そのうちTLR3とTLR7は内膜に位置し、それぞれウイルス由来の核酸の感知と抗ウイルス免疫応答の誘導において重要な役割を果たしています（Nishiya et al., 2005）。TLR3は二本鎖RNA（dsRNA）を認識し、TLR7は一本鎖RNA（ssRNA）とイミダゾキノリン誘導体に結合することができます（Alexopoulou et al., 2001; Diebold et al., 2004; Hemmi, 2002）。現在、中枢神経系（CNS）におけるTLR7の免疫応答はまだ完全には解明されていませんが、最近の研究によると、TLR7は西ナイルウイルス（WNV）やLangatウイルスなどの神経向性ウイルスに対する自然免疫において重要な役割を果たしていることが示されています（Town et al., 2009; Baker et al., 2013）。中枢神経系の主要な細胞タイプである星状膠細胞、ミクログリア、ニューロンはすべてTLR7を発現しています（Gern et al., 2021）。星状膠細胞とミクログリアにおけるTLR7シグナル経路の活性化は、神経向性ウイルスに対する免疫応答に不可欠です（Luo et al., 2019; Mukherjee et al., 2019）。さらに、TLR7/8アゴニストであるResiquimod（イミダゾキノリン化合物）はミクログリアを活性化し、C-C motif chemokine ligand 2（CCL2）を含む炎症性ケモカインを産生します（Kwon et al., 2022）。グリア細胞と同様に、ニューロンもTLR7を発現しています（Gern, 2021; Lehmann et al., 2012）。これは、TLR7リガンドに応答して免疫系を活性化できることを示唆しています。しかし、ニューロンにおけるTLR7発現の意義はまだ明確ではありません。したがって、本研究はResiquimodがSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞において炎症性ケモカインの発現を誘導するかどうかを確認することを目的としています。

研究出典

本論文は「ResiquimodはSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞においてNF-κBを介してCCL2の発現を誘導する」と題され、Masatoshi Kaizuka, Shogo Kawaguchi, Tetsuya Tatsuta, Mayuki Tachizaki, Yuri Kobori, Yusuke Tanaka, Kazuhiko Seya, Tomoh Matsumiya、Tadaatsu Imaizumiらの研究者によって執筆されました。著者らは弘前大学大学院医学研究科の消化器血液内科学講座、脳科学研究所血管生物学部門、呼吸器内科学講座、健康科学講座に所属しています。論文は2024年に「Neuromolecular Medicine」誌の第26巻に掲載され、論文番号は16です。本論文の責任著者はShogo Kawaguchiで、連絡先メールアドレスはkawaguchi.s@hirosaki-u.ac.jpです。

研究内容とプロセス

本研究は、詳細な実験設計とデータ分析を通じて、SH-SY5Y細胞におけるResiquimodによるCCL2発現誘導メカニズムを段階的に解明しました。

実験プロセス

  1. 細胞培養： SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞株を10％ウシ胎児血清（FBS）と100mg/mlペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12培地で培養しました。分化したSH-SY5Y細胞を得るために、細胞を10µM全トランスレチノイン酸を補充した培地で6日間培養し、2日ごとに培地を交換しました。

  2. 免疫蛍光顕微鏡（IF）： IF顕微鏡を用いてSH-SY5Y細胞におけるTLR7の発現を確認しました。細胞を固定後、特異的抗体で免疫染色し、光学顕微鏡下でTLR7、TLR3、核因子-κB（NF-κB）p65の局在と発現を観察しました。

  3. 定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）： 細胞から全RNAを抽出し、一本鎖cDNAを合成し、特異的プライマーを用いてqRT-PCRを行い、CCL2、CXCL8、CXCL10のmRNAレベルを評価しました。

  4. ウェスタンブロッティング： ウェスタンブロット法を用いて細胞溶解液中のIκB-α、p-p65、p65、Actinの発現を検出し、NF-κBシグナル経路の活性化を評価しました。

  5. 酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）： 細胞培養上清を回収し、ELISAキットを用いてCCL2、CXCL8、CXCL10のタンパク質レベルを測定しました。

  6. RNA干渉（RNAi）： 緩衝液中でリポフェクタミン試薬を用いてp65 siRNAまたは陰性対照siRNAをSH-SY5Y細胞にトランスフェクションし、p65のノックダウンがResiquimod誘導CCL2発現に与える影響を検討しました。

研究結果

  1. 基礎発現： IF顕微鏡の結果、TLR7とTLR3がSH-SY5Y細胞で恒常的に発現し、細胞核付近に局在していることが示されました。ResiquimodとPoly IC刺激後、CCL2、CXCL8、CXCL10のmRNAレベルが急速に上昇しました。

  2. 遺伝子発現の上昇： ResiquimodはCCL2、CXCL8、CXCL10の発現を濃度依存的に誘導し、ELISA検査の結果、ResiquimodはCCL2の分泌を著しく増加させましたが、CXCL8とCXCL10の変化は小さかったです。

  3. NF-κB依存性： ウェスタンブロットの結果、Resiquimodがp-p65の発現を著しく増加させ、p65の核内移行を引き起こすことが示されました。RNAi実験でさらに、p65のノックダウンがResiquimod誘導CCL2の発現と分泌を著しく減少させることが示されました。

研究結論

本研究は、ResiquimodがSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞においてNF-κB経路を活性化することでCCL2の発現を著しく誘導することを初めて明らかにしました。CCL2はその受容体CCR2を介して中枢神経系の免疫応答において重要な役割を果たします。結果は、Resiquimodがその免疫刺激作用を通じて中枢神経系ウイルス感染における潜在的な治療剤としての応用の可能性を示しています。

研究のハイライト

本研究の主なハイライトには以下が含まれます： 1. SH-SY5Y細胞におけるTLR7の基礎発現とResiquimodの刺激効果を確認しました。 2. ResiquimodがNF-κB経路を活性化してCCL2を誘導する分子メカニズムを詳細に解明しました。 3. 実験データはResiquimodが中枢神経系ウイルス感染における潜在的な免疫治療剤としての価値を支持しています。

研究の価値

本研究は、ニューロンにおけるTLR7の機能理解に新たな視点を提供し、神経ウイルス感染に対する免疫療法の開発の基礎を築きました。同時に、研究はニューロンとグリア細胞間のTLR7刺激相互作用の将来の研究方向を指摘し、非原発性ニューロン様細胞株の反応を十分に探索することの重要性を強調しました。

この研究は、神経科学と免疫学分野のさらなる研究に重要な理論的支持と実験的基盤を提供しています。