ミルベマイシンオキシム薬物中の3つの新規異性体不純物の分離と同定

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ミルベマイシンオキシム 異性体不純物 分離 同定 薬物分析 HPLC NMR

ミルベマイシンオキシム薬物中の3つの新規異性体不純物の分離と同定

学術的背景

ミルベマイシン（Milbemycins）は、ストレプトマイセス（Streptomyces）によって生成される16員環マクロライド系化合物の一種で、強力な抗寄生虫および殺虫活性を持ちながら、哺乳類に対する毒性は低い。ミルベマイシンおよびその誘導体は、農業および獣医学分野でさまざまな昆虫や寄生虫の制御に広く使用されている。ミルベマイシンオキシム（Milbemycin Oxime, MO）は、ミルベマイシンA3およびA4の酸化およびオキシム化反応によって調製される半合成製品であり、1990年に初めて市場に登場して以来、主に犬のフィラリア症の予防および他の内部寄生虫の制御に使用されている。

しかし、天然化合物から半合成される製品として、MOの合成過程では、残留する原料、中間体、分解生成物、および副生成物などの不純物が不可避的に生成される。これらの不純物は、薬物の品質と安全性に影響を与える可能性がある。欧州薬局方および米国薬局方はMO中の既知の不純物について規定しているが、未同定の不純物が依然として存在する。したがって、研究チームは、MO薬物中の未知の不純物を分離および同定し、薬物質量管理基準をさらに最適化することを目的とした。

論文の出典

本論文は、Xiaohan Ren、Jianwei Lu、Yefei Wu、Shaoyong Zhang、Huan Qi、Hui Zhang、Jidong Wang、およびLinghui Zhengによって共同執筆された。著者らは、湖州大学生命科学学院、浙江銭江生化有限公司、台州科技職業学院、および浙江匯達生物科技有限公司に所属している。本論文は、2024年11月28日にThe Journal of Antibiotics誌にオンライン掲載され、DOIは10.1038/s41429-024-00791-7である。

研究のプロセスと結果

1. 不純物の検出と分離

研究チームはまず、高速液体クロマトグラフィー-質量分析（HPLC-MS）を使用して、実験室で調製されたMOサンプルおよび2つの市販MO薬物（Milpro®およびHailechong®）を分析し、MO A4よりも14ダルトン分子量が高い2つの未知の不純物ピークを発見した。国際調和会議（ICH）ガイドラインによると、これらの不純物の含有量は0.10％〜0.15％の範囲であり、0.10％の同定閾値を超えているため、さらなる同定が必要であった。

これらの不純物を分離するために、研究チームは二次元（2D）調製法を開発した。まず、Agilent Zorbax-C3調製カラムを使用して一次元分離を行い、等度溶離（水/メタノール/アセトニトリル=30/35/35、v/v/v）を適用し、流速を1.5 mL/minとした。その後、Sepax Amethyst C18-H調製カラムを使用して二次元分離を行い、等度溶離（水/メタノール=15/85、v/v）を適用し、流速を1.5 mL/minとした。この方法により、研究チームは3つの不純物を分離することに成功し、それぞれ不純物1、不純物2、および不純物3と命名した。

2. 不純物の構造同定

これら3つの不純物の構造を決定するために、研究チームは高分解能質量分析（HRMS）および核磁気共鳴（NMR）技術を使用した。具体的な手順は以下の通りである：

  • 不純物1：1H NMRおよび13C NMR分析により、不純物1はMO A4と同じ骨格構造を持っているが、C-14位にメチル基がなく、代わりにエチル基が存在することが判明した。さらに、1H-1H COSYおよびHMBCスペクトル分析により、この構造が確認された。最終的に、不純物1は14-デスメチル-14-エチル-MO A4と同定された。

  • 不純物2：同様のNMR分析により、不純物2はMO A4と構造的に類似しているが、C-24位にメチル基がなく、代わりにエチル基が存在することが判明した。したがって、不純物2は24-デスメチル-24-エチル-MO A4と同定された。

  • 不純物3：NMR分析により、不純物3はMO A4と構造的に類似しているが、C-12位にメチル基がなく、代わりにエチル基が存在することが判明した。したがって、不純物3は12-デスメチル-12-エチル-MO A4と同定された。

3. 不純物の起源分析

研究チームはさらに、これらの不純物の起源を分析した。天然ミルベマイシン同族体の構造と比較することにより、これらの不純物は、発酵液中の天然ミルベマイシン同族体が酸化およびオキシム化反応を経て生成された可能性があることが明らかになった。この発見は、MO薬物の品質管理において重要な理論的根拠を提供する。

研究の結論と意義

本研究は、MO薬物中の3つの新規異性体不純物、すなわち14-デスメチル-14-エチル-MO A4、24-デスメチル-24-エチル-MO A4、および12-デスメチル-12-エチル-MO A4を分離および同定することに成功した。これらの不純物の同定は、MO薬物の品質管理における空白を埋めるだけでなく、薬物製造プロセス中の不純物管理に重要な参考を提供する。

さらに、研究チームが開発した二次元調製法は、不純物の分離効率を大幅に向上させ、複雑なサンプル中の高純度不純物の分離に新しい技術的手段を提供した。この方法の適用は、MO薬物の品質管理に限定されず、他の複雑な薬物の不純物分離および同定にも拡張可能である。

研究のハイライト

  1. 新規不純物の同定：MO薬物中の3つの新規異性体不純物を初めて分離および同定し、薬物質量管理における空白を埋めた。
  2. 二次元調製法：複雑なサンプル中の不純物分離効率を大幅に向上させる二次元調製法を開発した。
  3. 不純物の起源分析：天然ミルベマイシン同族体の構造と比較することにより、これらの不純物の生成メカニズムを明らかにし、薬物製造プロセス中の不純物管理に理論的根拠を提供した。

その他の価値ある情報

本研究は、浙江省自然科学基金（LGN22B020002）、湖州市公益性研究プロジェクト（2021GZ25）、および台州市科学技術計画プロジェクト（24NYB10）の支援を受けた。研究チームは、浙江匯達生物科技有限公司および浙江銭江生化有限公司の支援にも感謝している。

この研究を通じて、MO薬物の品質管理基準がさらに改善され、薬物の安全性と有効性の向上に重要な支援を提供した。今後、研究チームは二次元調製法をさらに最適化し、より多くの複雑な薬物の不純物分離および同定に適用することを計画している。