末梢血の単細胞RNAシーケンスにより、スプライシングの細胞タイプ特異的調節が自己免疫および炎症性疾患に関連していることが明らかに

2025-01-27 Mon
単細胞RNAシーケンススプライシング調節自己免疫疾患炎症性疾患細胞タイプ特異性遺伝的多様性アジア免疫多様性アトラス
シングルセルRNAシーケンシングが末梢血における細胞タイプ特異的スプライシング調節と自己免疫および炎症性疾患との関係を明らかにする背景紹介
近年、ゲノム研究の急速な進展により、複雑な形質の遺伝的基盤についての理解が大幅に深まりました。しかしながら、複雑な疾患と関連する多くのゲノム関連領域（GWAS loci）の機能的メカニズムは未だ完全には解明されていません。これらの領域の多くは、タンパク質を直接コードしない非コードゲノムに位置しており、転写後イベント、例えば選択的スプライシング（alternative splicing, AS）が遺伝子発現や複雑な疾患の遺伝的リスクにどのように影響を与えるかを理解することが重要です。選択的スプライシングは、遺伝子機能を調節し、遺伝子発現の多様性を創出する重要なメカニズムですが、特定の細胞タイプや遺伝的背景における役割はこれまであまり研究されてきませんでした。
さらに、大規模なシングルセルRNAシーケンシング（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技術は、個々の細胞レベルでの遺伝子発現パターンを偏りなく検出するための機会を提供しています。この技術は、異質な集団における異なる細胞タイプのゲノム調節特性を解明することを可能にします。しかし、従来のscRNA-seq手法では、3′末端の偏りがあるため、選択的スプライシングイベントの検出精度が制限されていました。
これらの研究の空白を補うため、アジアの多くの研究機関からなるチームは、末梢血単核細胞（PBMCs）における選択的スプライシングと自己免疫および炎症性疾患との関係を探索することに取り組みました。彼らは5′末端を利用したシングルセルトランスクリプトームシーケンシング技術を効率的に活用し、細胞および遺伝的背景におけるスプライシング調節の動的な変化を包括的に解析しました。
論文情報
この論文は「Single-cell RNA sequencing of peripheral blood links cell-type-specific regulation of splicing to autoimmune and inflammatory diseases」というタイトルで、2024年12月号の《Nature Genetics》誌に掲載されました。この研究はシンガポール国立大学、理化学研究所（RIKEN）、サムスン医療センターなどの複数機関による国際共同研究として実施され、アジアの民族多様性に基づいてシングルセルレベルで免疫関連疾患の遺伝的メカニズムを剖析したものです。
研究プロセスデータ生成と研究デザイン研究チームは「アジア免疫多様性アトラス（Asian Immune Diversity Atlas, AIDA）」のデータセットから、東アジア、東南アジア、南アジア地域（例えば日本、シンガポール、韓国など）の474名の健康なドナーから提供された末梢血サンプルを収集しました。各個体から平均約1,959個の単一細胞が採取され、合計で約100万個のシングルセルによるトランスクリプトームデータが生成されました。5′末端を対象としたscRNA-seq技術および内因性mRNAのランダム分解と端帽形成（recapping）を利用した結果、トランスクリプトームのエクソンカバレッジが大幅に拡張され、スプライシングの変化が詳細に解析可能となりました。
データ生成後、研究では32種類のPBMCサブタイプを区分し、単一細胞および擬似大規模化サンプル（pseudobulk）レベルで、それぞれ選択的スプライシングパターンを解析しました。これらの解析から、複数のエクソン発現差異イベント（DSEs）や、数千のスプライシング量的形質遺伝子座（splicing quantitative trait loci, sQTL）が見出されました。
データ解析と実験アプローチ研究は以下の主要なステップに分けられます：
1. 細胞種分類と選択的スプライシングイベントの定量遺伝子発現プロファイルをもとに、研究チームは34種類のPBMC細胞種を同定し、そのうち21種類の細胞サブタイプを十分なサンプル数で確保しました。単一細胞および擬似大規模化サンプルの両方のレベルで“SpliZ”解析ツールを用いて各細胞における選択的スプライシングイベントを定量しました。その結果、従来の3′末端偏向のscRNA-seq手法と比較して、この新手法では検出されたスプライシング関連遺伝子の数が4倍以上増加しました。
2. 性別および人種によるスプライシングへの影響研究では、性別と遺伝的背景の違いがスプライシングに与える重要な影響を明らかにしました。例えば、特定のT細胞サブタイプでは、FLNA遺伝子の短いスプライシングアイソフォームが女性サンプルで男性よりも有意に高いことが確認されました。また、人種間でのDSEの分析を通じて、特定の人種依存的なスプライシング調節が、集団内でのアレル頻度の変化に高度に相関していることが判明しました。例えば、SPSB2遺伝子のスプライシングサイトは、rs11064437によるアレルの違いによって顕著に変化し、スプライシングサイトの選択バイアスをもたらしました。
3. cis-sQTLとtrans-sQTLの検出5′偏向のシーケンス技術と先進的な統計モデリングを組み合わせた結果、10,874のタンパク質コード遺伝子および703の長鎖非コードRNA遺伝子に関するcis-sQTLが同定されました。また、607のtrans-sgenesが発見され、これらの遺伝子は遠方の調節位置に由来する影響を受けていました。特に、HNRNPLLの発現がPTPRCのスプライシングに与えるT細胞サブタイプ特異的な規制関係が明らかになりました。
4. 関連解析と病理メカニズムの研究研究では、アジア特異的な5′スプライシングサイトの変異（rs74416240）がTCHP遺伝子のエクソン4の不活性インロント形成を引き起こし、その結果としてグレーブス病（Graves’ Disease）の遺伝的リスクと密接に関連していることを特定しました。実験では、この変異が5′スプライシングサイトを破壊し、スプライシングに直接影響を与える仕組みがミニジーン（minigene）を使用して検証されました。
5. 動的スプライシングイベントとB細胞発達の関係研究では、B細胞発達過程においてスプライシングイベントの動的変化が明らかにされました。PAX5（B細胞特異的転写因子）のアイソフォーム比率の変化や、他の重要遺伝子であるPTPRCのスプライシング変化などが確認され、これらが遺伝子発現と細胞機能の進行性変化との関連を示唆しました。
研究結果と発見主な研究発見性別および人種特異的スプライシング調節

性別および遺伝的背景がエクソン使用パターンに与える影響が顕著であり、特に既知の免疫機能関連の重要な遺伝子（例：FLNAおよびSPSB2）においてこれが顕著に現れました。
広範囲のcis-sQTLおよびtrans-sQTL

研究では、特定の細胞タイプにおいて広範囲に存在するスプライシング調節信号が明らかになりました。例えば、HNRNPLLの発現は、転移効果を介してPTPRCのスプライシング構造を広範囲に再構築しました。
疾患とスプライシングの遺伝的関連

多くのcis-sQTLが自己免疫および炎症性疾患の遺伝的リスクと顕著に共局在していることが明らかになりました。特に、グレーブス病のアジア特異的なリスク遺伝子（TCHP rs74416240）に関する病因メカニズムが解明されました。
B細胞発達における動的スプライシング調節

B細胞発達が多くの重要遺伝子スプライシングの動的変化と有意に関連していることが明らかとなり、免疫細胞の進化メカニズムを探求する新しい方向性を示しました。
研究意義とハイライトこの研究はシングルセル解像度でスプライシングの種族および性差、さらには疾患感受性との関係を剖析し、以下のような重要な意義を持ちます：
- 技術的革新性：改良された5′シングルセルRNAシーケンス手法を用いることで、エクソンカバレッジとスプライシングイベント検出能力が大幅に向上しました。
- 民族多様性：希少な東南アジアおよび南アジア集団を具体的な研究対象としたことで、GWASゲノム研究にこれまでにない民族的豊かさを提供しました。
- 疾患メカニズムへの新たな洞察：グレーブス病や全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患に関連する重要なスプライシングメカニズムが特定され、複雑な疾患の遺伝的調節ネットワークの理解を深めました。
本研究は、選択的スプライシングが免疫機能および疾患において果たす重要な役割を明らかにするだけでなく、シングルセルスプライシングと遺伝的変異の包括的研究に道を開き、精密医療の発展に基盤を与えました。