CD28共刺激作用通过LCK/CD3ζ/ZAP70信号軸增强CAR-NK細胞の機能

研究の背景と目的

キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T細胞療法は、特定の進行がん患者において顕著な効果を示しています。しかしながら、CAR-T細胞療法には高コスト、製造プロセスの複雑さ、サイトカイン放出症候群や神経毒性など、多くの制限があります。そのため、研究者たちは代替方法の探求に向かっており、自然殺傷（Natural Killer, NK）細胞は、即時使用可能な細胞免疫療法として、移植片対宿主病（Graft-Versus-Host Disease, GVHD）を引き起こさないため、がん免疫療法の有望な候補となっています。

本研究では、CD70を標的とするCAR構築において、異なる共刺激分子がNK細胞の抗腫瘍活性に与える影響を研究し、最も効果的な共刺激シグナルドメインを探し出し、複数の異種移植モデルでその抗腫瘍効果を評価しました。

論文出典

本論文の主な著者には、Sunil Acharya、Rafet Basarなどがおり、彼らはテキサス大学MDアンダーソン癌症センター、ヒューストン大学などの研究機関に所属しています。この研究は《Cancer Discovery》誌に発表されました。

研究のプロセスと方法

研究プロセス概説

研究チームは、NK細胞に関連する共刺激シグナルドメイン（DAP10とDAP12）、T細胞に関連する共刺激シグナルドメイン（CD28）および二重共刺激シグナルドメイン（4-1BB）を組み込んだ複数のCD70に対するCARシステムを構築しました。研究は次のステップで進行しました：a) 異なるCAR構造のNK細胞の作成およびin vitroスクリーニング；b) これらのNK細胞のin vivoおよびin vitroでの抗腫瘍活性の分析；c) CD28共刺激作用が従来のT細胞受容体（TCR）シグナル経路を介してCAR-NK細胞の機能を強化するかどうかを探るための詳細なシグナルメカニズムの研究。

細胞の作成とCAR構築（生成およびin vitroスクリーニング）

研究者たちはまず、さまざまな固形がんおよび血液系悪性腫瘍におけるCD70の発現状況を詳細に分析し、組織マイクロアレイ免疫組織化学（Immunohistochemistry, IHC）技術およびフローサイトメトリーにより、CD70が複数のがんにおいて過剰に発現し、正常組織では低く発現していることを確認しました。これにより、CD70がCARの標的としての可能性を持っていることが実証されました。

次に、研究チームはCD27を基にした複数のCAR構造を設計し、それをNK細胞関連のDAP10/DAP12、T細胞関連のCD28および4-1BB共刺激シグナルドメインに結合させました。これらのCAR遺伝子を臍帯血由来のNK細胞に遺伝子導入し、in vitroでスクリーニングを行いました。実験の結果、CAR-NK細胞の遺伝子導入効率は類似しており、in vitroでの増殖およびサイトカインの分泌には顕著な違いは見られませんでした。各グループのCAR-NK細胞は様々ながん細胞株に対して異なる程度の細胞毒性を示し、その効果機能を評価しました。

長期および繰り返し刺激実験と多機能性分析

研究者たちは、長期間のin vitroでの繰り返し腫瘍再チャレンジ実験を通じて、腫瘍患者体内の複雑な環境をシミュレートしました。結果、CD28共刺激シグナルドメインを持つCAR-NK細胞（CAR27-28ζ）は、CD70陽性腫瘍細胞に対してより強力な長期細胞毒性を示しました。さらに、IsoPlexisプラットフォームを使用して単一細胞多機能性を分析した結果、CAR27-28ζ NK細胞は基礎状態およびCARによる刺激後にも高度の多機能性を示し、主に効果型およびケモカイン型サイトカインを分泌していることが判明しました。

時間飛行質量分光細胞計数（CYTOF）技術を使用して、研究者たちはCD28共刺激シグナルドメインを持つCAR-NK細胞が多回腫瘍細胞再チャレンジ後も高レベルの細胞殺傷能力を保持し、パーフォリンおよびグランザイムBなどのエフェクターサイトカインの高発現を維持していることを発見しました。

動物モデルでのin vivo実験

4種類の腫瘍モデル（2種類の血液系腫瘍モデルおよび2種類の固形腫瘍モデル）において、CAR27-28ζ NK細胞は顕著な抗腫瘍活性および生存率の向上を示しました。特に、高侵襲性のCD70+ Raji Burkittリンパ腫マウスモデルにおいて、CAR27-28ζ NK細胞は最も優れた抗腫瘍効果を示しました。

CD28共刺激シグナルのメカニズム研究

CD28共刺激シグナルがNK細胞における下流シグナル経路を探るために、研究者たちはCD28のPYAPドメインが削除された、またはITAMチロシン残基が変異した場合、NK細胞におけるCD3ζのリン酸化レベルが显著に低下することを発見しました。これは、LCKがCD28共刺激ドメインと結合することがシグナル伝達において重要であることを示唆しています。

一連の免疫沈降実験を通じて、研究者たちはZAP70がCD28を含むCAR構造中でCD3ζと結合することが顕著に強化されることを確認しました。さらに、ZAP70とCD3ζがLCKの関与を通じて完全なシグナルトランスダクション経路を形成することを実証しました。

研究の結論と意義

研究は、CD28共刺激シグナルドメインを統合することで、CD70を標的とするCAR-NK細胞の抗腫瘍活性を顕著に強化できることを発見しました。詳細なシグナルメカニズムの研究は、CD28がLCKをリクルートしCD3ζのリン酸化を促進することを通じて、下流シグナル伝達およびNK細胞のエフェクター機能を強化することを確認しました。

この研究は、学術的な新しい知見を提供するだけでなく、臨床におけるCAR-NK細胞のがん免疫療法への応用に理論的基盤を提供します。現在、この研究成果に基づく臨床I/II期試験が進行中であり、CD70陽性血液系悪性腫瘍および固形腫瘍患者におけるCD28共刺激ドメインのCAR-NK細胞の安全性および有効性を評価することを目的としています。

研究のハイライト

1. 標的選定：研究は、CD70が多くのがん種類における「広範な腫瘍抗原」としての潜在力を持つことを確認し、広範な臨床応用の可能性があることを示しました。
2. 共刺激シグナルドメイン：初めて複数の共刺激シグナルドメインがCAR-NK細胞に与える影響を体系的に評価し、CD28共刺激ドメインがNK細胞のエフェクター機能を強化する上で特有の優位性を持つことを発見しました。
3. シグナルメカニズム：CD28シグナルがCAR-NK細胞においてどのように機能するかの詳細メカニズムを解析し、LCK/CD3ζ/ZAP70シグナル軸が細胞活性化および抗腫瘍機能において重要な役割を果たしていることを明らかにしました。

本研究は、CAR-NK細胞の臨床応用を進めるための重要な理論的支持および実験的基盤を提供し、がん免疫療法分野において重要な意義を持っています。