科研報道：解析NEB病変変異発見新型線状筋症の病理機序及びOmecamtiv Mecarbilの力学影響

背景と研究動機

線状筋症（Nemaline Myopathy, NEM）は稀な異質性遺伝病で、主に筋力低下と筋肉無力が特徴である。病理上、この病気は筋小節Z盤の失序と線状小体の蓄積によって引き起こされる。線状小体はZ盤と細糸蛋白の集合体である。この病気の発病率はおおよそ10万人の生存出生児に2例ほどで、先天性筋症の17%を占める。現在、この病気の有効な治療法は存在しない。

線状筋症は少なくとも13種類の遺伝子の致病変異に関与しており、その中でもNEB遺伝子の変異が主要な原因で、病理変異の35%を占める。NEB遺伝子は巨大細糸蛋白であるnebulinをコードしており、骨格筋の細糸長調節（thin filament length, TFL)、筋小節の整合及びブリッジサイクルなど重要な生理過程で重要な役割を果たしている。したがって、本稿ではNEB遺伝子の致病変異、それがmRNA、蛋白質及び力学特性に与える影響を詳細に研究し、新しい致病機序を明らかにし、Omecamtiv Mecarbilという薬物が病患の筋肉機能改善にどのように寄与する可能性があるかを検証する。

研究の出典

この研究はEsmat Karimi、Jochen Gohlke、Mila Van Der Borghらがアメリカのアリゾナ大学、ウィスコンシン医学院、アムステルダム大学医療センターなどの研究者との共同研究で行い、2024年に《Acta Neuropathologica》に発表した。

研究の流れ

研究対象とサンプル処理

本研究には異なる病理変異タイプのNEM2患者10名と、筋症状がない健康な対照者3名が含まれる。全ての筋肉生検サンプルはウィスコンシン医学院の先天性筋症組織バンク（CMD-TR）から取得され、−80°Cで凍結保存され、RNASEq分析及び蛋白質表現解析に供された。

RNAシーケンシング

凍結した筋肉組織は専用のRNA処理を経た後、RNAを抽出し、RNAシーケンシングを行った。シーケンシング後、特定のソフトウェアを用いてRNAデータを分析し、NEB遺伝子の転写とRNAスプライシングに及ぼす変異の影響を調べた。結果、多くの遮断型変異がNEB mRNAの安定性に影響し、nmd（無義性介在劣化、nonsense-mediated decay）を引き起こした。また、病人サンプルにおいて、高い割合で隠れスプライシング部位の活性化も観察され、これらの隠れスプライシング部位は通常、変異下でのみ活性化される。

蛋白質発現解析

SDS-アガロースゲル電気泳動とウエスタンブロット法によりnebulin蛋白質の発現を評価し、検出されたnebulin蛋白質レベルを骨格筋のミオシン重鎖（myosin heavy chain, MHC）と標準化対比した。結果として、部分的な患者ではnebulin蛋白質レベルが正常に近く、一部の患者では顕著に低下していた。また、Alphafoldによって予測されたnebulinのαヘリックス部分構造では、隠れスプライシング部位による挿入がactin結合部位を破壊する可能性があることが明らかになった。

筋肉繊維力学特性

膜浸透単繊維にて力学分析が行われ、異なるカルシウムレベルでの筋肉の力学特性を測定し、Omecamtiv Mecarbil（OM）処理前後の最大力と亜極大力が測定された。結果として、患者のOMは亜極大力を顕著に増加させ、この増加はnebulinレベルが最も低い患者で特に顕著であった。

薄糸長測定

蛍光標識のファロイジンを用いて筋肉組織を染色し、薄糸長を測定した。部分的な患者では薄糸長が短縮しているのに対し、長いnebulin蛋白を持つ患者では更に長い薄糸長が観察された。

主な発見と結論

遺伝子変異及び転写・蛋白レベルへの影響

研究によれば、遮断型変異は一般的にmRNAの降解によりnmdプロセスを経て呼び起こされる。このメカニズムは、なぜ蛋白質レベルで遮断されたnebulin蛋白が検出されないかを説明する。また、隠れスプライシング部位の活性化は不合理なRNAスプライシング及び非典型挿入を引き起こし、それがNEB転写と蛋白質レベルに様々な影響を及ぼす可能性がある。

蛋白表現レベルと筋肉機能の関係

nebulin蛋白レベルの低下は薄糸長（TFL）の短縮及び筋肉トーンの低下と負の相関関係にある。この現象は蛋白質レベルが最も低い患者において最も顕著である。さらに、NEBの拡張変異による長いnebulin蛋白を持つ患者ではTFLが長いという新たな発見があり、線状筋症は短い細糸だけでなく、長い細糸にも関係する可能性があることが明らかになった。

薬物治療の可能性

OMは小分子激動剤として、NEM2患者の亜極大力を顕著に増加させることができ、特にnebulinレベルが最も低い患者においてその効果が顕著である。OMはカルシウム感受性を増加させ、強結合状態のミオシン頭部の持続時間を延長することにより、亜極大活性化レベルでの力を顕著に高める。この発見は将来のNEM患者治療におけるOMの潜在的応用の基礎を築いた。

研究の意義と応用価値

本研究はNEB病変変異の新しい機序を初めて明らかにし、隠れスプライシング部位の活性化が不規則なスプライシング及びnebulinと薄糸長への影響を示した。さらに重要なのは、OMがNEM2患者の筋肉機能を改善する有望な薬物となり得ることを示し、特にnebulinレベルが低い患者に有効であることを示した。この発見は線状筋症の分子機構の理解を深め、具体的な治療法の開発に有益な情報を提供する。

研究のハイライト

1. 新しい病理機序を明示：隠れスプライシング部位の活性化による不規則なRNAスプライシング現象と蛋白機能への影響を初めて発見。
2. OM治療の可能性：OMがNEM2患者の筋肉受力を顕著に強化し、特にnebulinレベルが低い患者に対して効果が高いことを発見。
3. 蛋白質レベルと機能の関係：nebulin蛋白質レベル、薄糸長、筋肉受力間の負の相関関係を詳細に研究し、その重要な根拠を提供。

本研究は線状筋症治療に新しいアイデアと潜在的な解決策を提供し、高い研究および臨床応用価値を有している。