EGCG は LPS/AβO 誘発性の ROS/Txnip/NLRP3 経路を介した神経炎症を BV2 細胞で抑制する

2024-08-02 Fri
アルツハイマー病アミロイド β エピガロカテキンガレート NLRP3 インフラマソーム Txnip
エピガロカテキンガレート（EGCG）によるROS/TXNIP/NLRP3経路の調節を介したBV2細胞における神経炎症の抑制研究背景アルツハイマー病（Alzheimer’s Disease, AD）は、主に高齢者に発症する進行性の脳疾患で、持続的な認知機能障害と行動障害を特徴とします。ADの神経病理学的変化には、β-アミロイド（Aβ）の蓄積、異常な神経原線維変化（Neurofibrillary Tangles, NFTs）、および脳内の神経細胞の喪失が含まれます。研究によると、Aβの慢性的な蓄積はミクログリアを活性化し、慢性炎症を引き起こし、最終的に神経細胞死と認知機能障害につながります。さらに、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体ファミリーピリンドメイン3（NLRP3）インフラマソームの活性化は、ミクログリアの炎症とADに密接に関連しています。したがって、インフラマソームの活性化を予防することがADの潜在的な治療介入となる可能性があります。
研究動機現在の研究では、多くのNLRP3インフラマソーム刺激物質が活性酸素種（Reactive Oxygen Species, ROS）の産生を誘導し、ROSの増加がインフラマソームの活性化に不可欠であることが示されています（Dominic et al. 2022）。ROSはNLRP3インフラマソームの形成と活性化を引き起こす重要な要因とされており（Billingham et al. 2022）、ROS水準の上昇の主な原因はミトコンドリア機能障害です（Angelova and Abramov 2018）。TXNIP（チオレドキシン相互作用タンパク質）はROS除去タンパク質チオレドキシン（Trx）の内因性阻害剤であり、酸化ストレスとNLRP3インフラマソームの間の橋渡し役です。このような背景の下、本研究は緑茶に含まれるポリフェノール物質であるエピガロカテキンガレート（Epigallocatechin-3-Gallate, EGCG）の抗炎症メカニズムに焦点を当てています。
研究出典この研究は、安徽医科大学薬学部のYanyan Xiao、Chenglin Yang、Nana Si、Tao Chu、Jiahui Yu、Xintong Yuan、Xiang-Tao Chenによって行われました。論文は「Journal of Neuroimmune Pharmacology」に掲載され、2024年6月8日に正式に受理されました。URLはhttps://doi.org/10.1007/s11481-024-10131-zです。
研究プロセス科学実験部分EGCGのBV2細胞における炎症抑制効果を検証するために、以下の手順で実験を行いました：
細胞培養および処理：
BV2細胞（北京、中国）を不完全な高グルコースDMEM培地で培養し、10％ウシ胎児血清（FBS）と1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加し、37℃、5％CO2インキュベーター内で培養しました。
炎症誘導と薬物処理：
実験手順には以下が含まれます：
BV2細胞をEGCG（5 µM、10 µM、20 µM）溶液またはMCC950（10 µM）、NAC（20 mM）、ミトキノン（MitoQ, 0.2 µM）に1時間曝露しました。
その後、LPS（1 µg/ml）で1時間処理し、さらにAβ1-42オリゴマー（Aβo）（10 µg/ml）で6時間処理して炎症反応を誘導しました（Zhong et al. 2019）。
細胞活性検出：
CCK-8キットを使用してBV2細胞の生存率を測定し、顕微鏡で450nm波長の吸光度を測定しました。
ウェスタンブロット分析とRT-PCR：
BV2細胞のタンパク質レベル（IL-1β、TNF-α、IBA-1、NLRP3、Caspase-1など）を分析し、実験を通じて細胞間の炎症指標の変化を確認しました。
免疫蛍光検出と細胞内ROS検出：
蛍光顕微鏡を用いてBV2細胞のROS産生を観察し、DCFH-DA染色法で細胞内ROSレベルを検出しました。
ミトコンドリア膜電位検出：
JC-1蛍光プローブを用いてBV2細胞のミトコンドリア膜電位変化を検出し、ミトコンドリア損傷下でのROS産生状況を分析しました。
研究結果EGCGのLPS/Aβo誘導BV2細胞における炎症反応抑制効果EGCG処理後、BV2細胞の関連炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）のmRNA発現レベルが著しく低下し（図1a-c）、対応するタンパク質レベルの発現も著しく減少しました（図1d-i）。免疫蛍光染色によってさらに、EGCGが炎症反応の誘発とAβ沈着を減少させることが確認されました（図1j）。
EGCGのLPS/Aβo誘導炎症反応に対するNLRP3インフラマソーム活性化抑制を介した効果BV2細胞における炎症抑制メカニズムを調査する中で、EGCGがNLRP3、ASC、Caspase-1などのインフラマソーム関連分子の発現レベルを低下させることが分かりました（図2a-e）。特にIL-1βの発現がEGCG処理後に著しく低下し、これはインフラマソーム活性化に対する抑制効果を裏付けています。さらに、インフラマソーム阻害剤MCC950と活性化剤ATPを使用して、EGCGのNLRP3インフラマソーム抑制メカニズムを検証しました（図2f-h）。
EGCGの酸化ストレス減少を介したLPS/Aβo誘導BV2細胞におけるNLRP3インフラマソーム活性化抑制内因性ROS産生の増加はNLRP3インフラマソーム活性化の重要な要因です。本研究では、蛍光プローブ染色法を用いて、EGCGがLPS/Aβo誘導の細胞内ROSレベルを著しく減少させることを発見し、ROS阻害剤NACとROS活性化剤tBHPを用いてその効果を検証しました（図3a-b）。
EGCGのミトコンドリア機能障害によるROS抑制実験ではさらに、EGCGがミトコンドリア機能障害を介してROSの生成を抑制するかどうかを調査しました。結果は、EGCGとミトコンドリア特異的ROS阻害剤MitoQが類似の効果を示しました（図4a）。JC-1蛍光プローブを用いて、EGCGとMitoQの両方がミトコンドリア損傷誘導の緑色蛍光比率を減少させることが分かりました（図4b-f）。
EGCGによるNLRP3インフラマソーム活性化調節におけるTXNIPの役割重要なシグナル分子として、TXNIPは酸化ストレスとNLRP3インフラマソーム活性化の間で重要な役割を果たしています。本研究では、EGCGがLPS/Aβo誘導のBV2細胞におけるTXNIPの発現を抑制し、siRNAノックダウンと過剰発現実験を通じてEGCGの抑制効果をさらに確認しました（図5a-i）。
結論および意義この研究は、EGCGがROS/TXNIP/NLRP3経路を介して神経炎症を抑制する潜在的メカニズムを示し、ADの治療に新たな視点を提供しました。本研究の薬理学的メカニズムはin vitroモデルで検証されましたが、in vivoモデルにおける薬物動態学や他の分子との相互作用についてはさらなる研究が必要です。EGCGのインフラマソーム活性化抑制の新しいメカニズムを強調することで、この研究はADの予防と治療に新たな潜在的ターゲットを提供し、抗炎症治療の新しい道筋を明らかにしました。
研究のハイライトEGCGがミトコンドリアROS/TXNIP/NLRP3経路を介して神経炎症を抑制するメカニズムを初めて明らかにしました。
EGCGは顕著な抗炎症および神経保護作用を示し、ADの治療に潜在的な新しいアプローチを提供しました。
標的治療の可能性のある経路を提供し、今後の研究に重要な指針を与えました。
研究の限界と今後の方向性EGCGはin vitro研究で優れた抗炎症効果を示しましたが、in vivoモデルにおける薬効はさらなる検証が必要です。特に、脳内での生物学的利用能と具体的なシグナル機構に関しては更なる研究が求められます。また、EGCGと他の抗炎症薬や神経保護薬との併用の可能性も探究に値します。