麻酔におけるミトコンドリア遺伝子コード電圧インジケーターの開発と応用

2024-08-04 Sun
ミトコンドリア遺伝子コード電圧指示器膜電位ファイバーフォトメトリーイソフルラン誘発麻酔
遺伝子コード化電圧インジケーター(GEVIs)のミトコンドリア標的応用背景と研究動機ミトコンドリアは真核細胞のエネルギー工場として、生体エネルギー変換、代謝物合成、細胞生存、カルシウム貯蔵、熱産生など、多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。脳や心臓など、好気的代謝を大量に必要とする器官では、ミトコンドリアの正常な機能が特に重要です。ニューロンや心筋細胞の静止膜電位の維持には大量のエネルギーを必要とし、これは主にナトリウム-カリウムポンプ（Na+/K+ ATPase）によって実現されます。ミトコンドリア内膜には、キャリア、イオンチャネル、イオンポンプが含まれており、様々な物質の輸送を担当し、ミトコンドリア膜電位（MMP, ψm）を生成し影響を与えています。ψmは、エネルギー生産、活性酸素種（ROS）の形成、代謝基質やイオンの膜輸送の促進など、様々な細胞生理学に関連しています。さらに、ψmはミトコンドリアの形態にも影響を与え、ミトコンドリアの貪食や細胞死などのプロセスにも関与しています。
現在、ミトコンドリア膜電位（Δψm）の測定方法は、脂溶性カチオン染料の分布に依存しています。しかし、MMPに対する遺伝子コード化蛍光インジケーター（GEVIs）はまだ存在しません。この研究は、この欠落に対処し、ミトコンドリアを標的とし、その膜電位の動的変化をモニターできるGEVIsをスクリーニングし開発することを目的としています。
研究出典と著者情報この論文はRun-Zhou Yang、Dian-Dian Wang、Sen-Miao Li、Pei-Pei Liu、Jian-Sheng Kangらによって執筆され、鄭州大学第一附属病院臨床システム生物学研究室、鄭州大学第一附属病院神経科、鄭州大学医学院などの機関が関与しています。この研究は2024年にNeurosci. Bull.に掲載されました。
研究プロセスと方法研究対象と実験デザイン研究では最初に、GFP由来のArclight、ASAP1、および視覚ロドプシン由来のSomoarchonとPROPSを含む4種類のGEVIsを選択しました。これらのGEVIsは、N末端にミトコンドリア標的シグナル配列（mt, 4cox8）を融合させることでミトコンドリアを標的としました。研究ではこれらのGEVIsのミトコンドリア標的効率を評価し、細胞実験を通じてその電圧感受性を検証しました。
細胞培養と遺伝子導入実験ではHEK293T、COS-7、HeLa細胞を使用し、これらの細胞は10%胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で培養され、37°C、5% CO2/95%空気環境下で成長させました。短期発現のために、リン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞に遺伝子導入を行いました。
細胞イメージングと共局在分析レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行い、ImageJソフトウェアを使用して共局在分析を行い、ピアソン相関係数を定量化してミトコンドリア標的効率を評価しました。
初代心筋細胞とニューロンの分離と培養実験では0日齢のC57BLマウスの心臓と海馬を用いて組織解剖を行い、トリプシンとコラゲナーゼで組織を消化し、研磨したガラス管でさらに細胞を解離した後、マトリゲルでコーティングしたカバーガラス上に播種しました。心筋細胞は24時間後に自発的な拍動を開始し、海馬組織の細胞はさらに解離と遠心分離を経て単細胞を得た後、播種し培養しました。
ウイルスの調製と形質導入アデノ随伴ウイルス（AAV）とレンチウイルスを用いて心筋細胞とニューロンに遺伝子導入を行いました。ウイルスはリン酸カルシウム沈殿法を用いてHEK293T細胞に遺伝子導入して調製し、凍結融解サイクル法でウイルスを抽出しました。
安定形質転換細胞株の構築レンチウイルス形質導入と続く選別により安定形質転換細胞株を構築しました。細胞はチオフラキシンを含む培地で成長させ、PCRとシーケンシングによってプラスミド配列の存在を確認しました。
電気生理学と電圧イメージング室温下で全細胞パッチクランプ記録を行い、カスタムの光電システムを使用し、データ取得レートは10 kHzでした。電圧クランプモードで細胞活動を記録し、カメラのトリガーモードを設定して電圧パルスを捕捉しました。
生細胞イメージングTyrode緩衝液を含む蛍光顕微鏡下で細胞のイメージングを行い、ストリーミングモードで画像を取得しました。自発的な電圧変動を捉えるために、ストリーミングモードで画像を取得しました。
in vitroスクリーニングシステムpcDNA3.1(-)ベクターにT5プロモーターとShine-Dalgarno配列を挿入し、原核生物と哺乳類細胞での発現を可能にしました。PCRと配列分析により高蛍光の細菌クローンをスクリーニングし、さらなる分析を行いました。
実験結果スクリーニングと検証HeLaまたはCOS-7細胞において、研究はGEVIsの中でmt-ASAP1が最高のミトコンドリア標的効率を示し、電圧感受性も示すことを発見しました。さらに、心筋細胞においてmt-ASAP1がROSに感受性を示すことが分かりました。様々な変異を通じて、研究は高い電圧感受性を持ちROSに感受性のない変異体ASAP3-stを開発しました。
ミトコンドリア膜電位の低下麻酔過程において、ファイバーフォトメトリー実験を用いて研究を行い、麻酔がミトコンドリアの脱分極を引き起こすことを発見し、mt-ASAP3-stがこの変化を効果的にモニターできることを示しました。
結論この研究は4種類のミトコンドリアを標的とするGEVIsの開発に成功し、様々な細胞タイプにおいてその電圧感受性とROS感受性を検証しました。研究結果は、様々な生理学的および病理学的プロセスにおけるミトコンドリアの役割のさらなる理解に貢献し、ミトコンドリア機能障害の治療薬開発のための高スループットスクリーニングツールを提供しました。
研究のハイライト4種類のミトコンドリア標的遺伝子コード化電圧インジケーター（MPI-1からMPI-4）を開発し、様々なタイプの細胞での応用を検証しました。
心筋細胞でのmt-ASAP1のROS感受性の問題を発見し解決し、変異を通じてROSに感受性のないmt-ASAP3-stを開発しました。
ファイバーフォトメトリー実験を通じて、麻酔によるミトコンドリア膜電位の脱分極を初めて生体内でモニターし、麻酔薬のミトコンドリア機能への影響の理解に新たな視点を提供しました。
研究の意義この研究は、ミトコンドリア膜電位をモニターするツールを豊かにしただけでなく、エネルギー代謝に関連する生理学的および病理学的プロセスの深い研究のための新しい手段を提供しました。これらのGEVIsは、薬物スクリーニング、疾患モデル研究、基礎生物学研究において広範な潜在的応用を持っています。