基因组医学中的CRISPR引导序列再注释：EXORCISE算法的应用与验证

生物工程 肿瘤学 医学 遗传学 生命科学 细胞生物学
CRISPR 基因组注释 生物信息学 计算生物学 软件工具

基因组医学中的CRISPR引导序列再注释：EXORCISE算法的应用与验证

学术背景

CRISPR-Cas9技术自问世以来，彻底改变了基因筛选领域，尤其是在研究基因必需性和化学-遗传相互作用方面。通过设计针对特定基因的引导RNA（guide RNA, gRNA），CRISPR-Cas9系统能够在细胞中引入精确的基因敲除，从而帮助研究人员理解基因功能及其在疾病中的作用。然而，CRISPR库的设计通常基于参考基因组，而实际研究的细胞系（尤其是癌症细胞系）往往存在基因组变异，这可能导致CRISPR引导序列的错配或偏差，进而影响实验结果的准确性。

为了解决这一问题，Simon Lam等人开发了一种名为EXORCISE（Exome-Guided Re-annotation of Nucleotide Sequences）的算法，旨在通过基因组比对和外显子注释来重新注释CRISPR引导序列，从而纠正CRISPR库中的错误注释，并提高基因筛选的发现能力。

论文来源

该论文由Simon Lam、John C. Thomas和Stephen P. Jackson共同撰写，他们均来自英国剑桥大学的Cancer Research UK Cambridge Institute。论文于2024年发表在《Genome Medicine》期刊上，题为“Genome-aware annotation of CRISPR guides validates targets in variant cell lines and enhances discovery in screens”。

研究流程与结果

1. EXORCISE算法的开发与实现

EXORCISE算法的核心思想是通过比对CRISPR引导序列与用户提供的基因组，并结合外显子注释，重新注释CRISPR库中的引导序列。具体流程如下：

  1. 引导序列比对：首先，将CRISPR引导序列与用户提供的基因组进行比对，使用BLAT（BLAST-like alignment tool）工具进行精确匹配。
  2. 切割位点确定：对于每个匹配的引导序列，确定Cas9的切割位点，通常位于PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列上游的第3和第4个核苷酸之间。
  3. 外显子注释：将切割位点与外显子注释进行比对，若切割位点位于外显子内，则将该引导序列注释为靶向该外显子所属的基因。
  4. 重新注释输出：最终输出重新注释后的CRISPR引导序列库，并生成基因级别的映射关系。

2. 商业化CRISPR库的评估

研究人员使用EXORCISE算法对55个商业化CRISPR库进行了重新注释，发现这些库中普遍存在以下问题：

  • 脱靶效应：部分引导序列靶向多个基因的外显子，导致脱靶效应。研究发现，脱靶效应在RefSeq外显子注释中占7.4%，而在更宽松的GENCODE注释中则上升至12.9%。
  • 错失靶效应：部分引导序列未能靶向任何外显子，导致错失靶效应。在RefSeq注释中，错失靶效应占16.1%，而在GENCODE注释中降至9.6%。
  • 假非靶效应：部分引导序列的有效靶向注释缺失，导致假非靶效应。

3. 模拟CRISPR筛选实验

为了评估常见注释错误对CRISPR筛选结果的影响，研究人员构建了一个合成基因组，并模拟了CRISPR筛选实验。通过引入不同的注释错误（如假非靶效应、错失靶效应和边界效应），研究人员发现：

  • 假非靶效应：虽然减少了发现的基因数量，但保留了发现的精确性。
  • 错失靶效应：引入了额外的非靶向引导序列，显著削弱了发现能力。
  • 边界效应：将外显子边界错误地扩展到邻近基因，导致最强的信号被保留，但中等强度的信号发现能力受损。

4. 应用于DepMap和DDRCS数据集

研究人员将EXORCISE算法应用于DepMap（癌症依赖图谱）和DDRCS（DNA损伤反应CRISPR筛选门户）数据集，发现重新注释后的CRISPR库在中等强度的信号发现能力上有所提升。特别是在癌症细胞系中，EXORCISE能够通过转录组数据推断外显子注释，从而纠正错失靶效应。

5. 新库设计与验证

研究人员还设计了基于EXORCISE的“VBC理想人类”和“VBC理想小鼠”CRISPR库，通过去除脱靶效应和错失靶效应的引导序列，确保了库中每个基因的引导序列数量一致。实验表明，这些库在靶向效率和发现能力上表现优异。

结论与意义

EXORCISE算法的开发为CRISPR筛选实验提供了重要的工具，特别是在处理基因组变异的细胞系时。通过重新注释CRISPR引导序列，EXORCISE能够纠正常见的注释错误，提高实验的准确性和发现能力。该算法不仅适用于CRISPR库的设计阶段，还可以用于已完成筛选实验的再分析。

研究亮点

  1. 纠正常见注释错误：EXORCISE能够有效识别并纠正CRISPR库中的脱靶效应、错失靶效应和假非靶效应。
  2. 提高中等强度信号的发现能力：通过重新注释，EXORCISE能够增强中等强度信号的发现，从而揭示更多潜在的基因-药物相互作用。
  3. 适用于多种细胞系：EXORCISE支持用户自定义基因组和外显子注释，适用于多种细胞系，尤其是基因组不稳定的癌症细胞系。

应用价值

EXORCISE算法的应用不仅限于CRISPR筛选实验，还可以用于其他基于基因组比对的DNA序列注释任务。该算法的开源性质（Creative Commons Zero 1.0 Universal Licence）使其能够被广泛使用，进一步推动基因组学和CRISPR技术的研究与应用。

通过EXORCISE算法，研究人员为CRISPR筛选实验提供了一种强大的工具，能够有效纠正常见的注释错误，提高实验的准确性和发现能力。该算法的开发和应用为基因组学和CRISPR技术的研究开辟了新的道路。