CRISPR-Cas9遺伝子編集技術は、特にキメラ抗原受容体T細胞（CAR-T細胞）の開発において、がん治療への応用が大きく進展しています。しかし、CRISPR編集プロセス中に引き起こされる染色体異常（大規模な欠失、染色体転座、異数性など）は、臨床応用における大きな懸念材料となっています。これまで、CRISPR-Cas9システムのコンポーネントを最適化することでこれらのリスクを軽減する研究が進められてきましたが、T細胞受容体（TCR）の活性化後の急速な増殖など、T細胞の内在的特性がゲノム安全性に与える影響は十分に研究されていませんでした。そこで、Laurenz T. Urschらは、TCR活性化と細胞増殖がCRISPR編集結果に与える影響を調査し、CRISPRでエンジニアリングされたT細胞のゲノム安全性を向上させるための戦略を探る研究を行いました。

論文の出所

この論文は、Laurenz T. Ursch、Jule S. Müschen、Julia Ritterらによって執筆され、ドイツのミュンヘン工科大学（Technical University of Munich）やフライブルク大学医学センター（University of Freiburg Medical Center）などの機関に所属する研究者が参加しています。論文は2024年12月17日に『Cell Reports Medicine』誌に掲載され、タイトルは「Modulation of TCR Stimulation and Pifithrin-α Improves the Genomic Safety Profile of CRISPR-Engineered Human T Cells」です。

研究の流れと結果

研究の流れ

1. T細胞の活性化とCRISPR編集結果の関係
   研究ではまず、活性化されていないT細胞と活性化されたCD4 T細胞のCRISPR編集後の結果を比較しました。安全な遺伝子座であるAAVS1、表面受容体CD4、活性化依存性受容体PD-1を標的として、Cas9リボ核タンパク質（Cas9 RNPs）を使用して編集を行いました。編集後、T細胞は非活性化グループと抗CD3/CD28抗体で活性化されたグループに分けられました。4日後、フローサイトメトリーを用いてCD4とPD-1のタンパク質発現レベルを測定し、次世代シーケンシング（NGS）を用いてAAVS1の編集効率を分析しました。その結果、活性化されたT細胞ではCD4とPD-1のノックアウト効率が高くなりましたが、同時に大きな欠失断片が生じることがわかりました。

2. T細胞の増殖速度と欠失断片の大きさの関係
   研究者らはさらに、T細胞の増殖速度がCRISPR編集結果に与える影響を調査しました。CFSE色素でCD4 T細胞を標識し、CFSEの希釈パターンに基づいて細胞を急速増殖グループと緩慢増殖グループに分けました。その結果、急速に増殖するT細胞では編集後に大きな欠失断片が生じることがわかりましたが、緩慢に増殖する細胞ではより小さな欠失が観察されました。

3. Pifithrin-α（PFT-α）がCRISPR編集結果に与える影響
   研究者らは、2種類のp53阻害剤であるPifithrin-α（PFT-α）とPifithrin-m（PFT-m）がCRISPR編集結果に与える影響をテストしました。その結果、PFT-αは活性化されたT細胞において欠失断片の大きさを減少させることがわかりましたが、PFT-mは欠失断片をわずかに増加させました。さらに、PFT-αの作用はp53に依存せず、CRISPRでエンジニアリングされたT細胞の機能を維持することが明らかになりました。

4. PFT-αがT細胞の機能に与える影響
   PFT-αの臨床応用の可能性を評価するため、研究者らはPFT-α処理後のT細胞のin vitroおよびin vivoでの機能を検証しました。その結果、PFT-α処理後のT細胞は、サイトカイン分泌、T細胞サブセットの組成、腫瘍細胞の殺傷能力において対照群と有意な差は見られませんでした。

5. PFT-αが染色体異常と異数性に与える影響
   単一ターゲットリンカー媒介PCRシーケンシング（CAST-seq）および単細胞核型シーケンシング（scKaryo-seq）を用いて、研究者らはPFT-αがCRISPR編集によって引き起こされる染色体転座と異数性を有意に減少させることを発見しました。

主な結果

1. T細胞の活性化と欠失断片の大きさの関係
   活性化されたT細胞はCRISPR編集後に大きな欠失断片を生じましたが、非活性化T細胞ではより小さな欠失が観察されました。

2. T細胞の増殖速度と欠失断片の大きさの関係
   急速に増殖するT細胞は編集後に大きな欠失断片を生じましたが、緩慢に増殖する細胞ではより小さな欠失が観察されました。

3. PFT-αが欠失断片の大きさに与える影響
   PFT-αは活性化されたT細胞において欠失断片の大きさを減少させ、この作用はp53に依存しないことが明らかになりました。

4. PFT-αがT細胞の機能に与える影響
   PFT-α処理後のT細胞は、サイトカイン分泌、T細胞サブセットの組成、腫瘍細胞の殺傷能力において対照群と有意な差は見られませんでした。

5. PFT-αが染色体異常と異数性に与える影響
   PFT-αはCRISPR編集によって引き起こされる染色体転座と異数性を有意に減少させました。

結論と意義

この研究は、TCRの活性化と細胞増殖がCRISPR編集プロセス中の染色体異常の重要な駆動要因であることを示しています。T細胞の活性化を制御し、PFT-αを添加することで、CRISPRでエンジニアリングされたT細胞のゲノム安全性を大幅に向上させることができます。PFT-αは欠失断片の大きさを減少させるだけでなく、T細胞の機能を維持するため、CRISPRでエンジニアリングされたT細胞の臨床応用における新たな戦略を提供します。

研究のハイライト

1. 重要な発見
   TCRの活性化と細胞増殖はCRISPR編集プロセス中の染色体異常の重要な駆動要因であり、PFT-αはT細胞の機能に影響を与えずにこれらの異常を減少させることができます。

2. 方法論の革新
   この研究は初めて、T細胞の活性化と増殖がCRISPR編集結果に与える影響を体系的に調査し、T細胞の活性化を制御しPFT-αを添加することでゲノム安全性を向上させる戦略を提案しました。

3. 応用価値
   この研究は、CRISPRでエンジニアリングされたT細胞の臨床応用における新たな安全性保証を提供し、科学的および応用的な価値が高いです。

その他の価値ある情報

この研究では、PFT-αが異なるT細胞サブセットにおいて特異的な効果を持つことも明らかにしました。また、in vitroおよびin vivo実験を通じて、PFT-α処理後のT細胞が腫瘍治療において有効であることを検証しました。