WWP1はTXNIPを介して急性骨髄性白血病細胞の酸化還元状態を調節する

背景紹介

急性骨髄性白血病（AML）は、未成熟な白血病細胞（白血病芽球）が骨髄内で異常に増殖する悪性血液疾患です。近年、AMLの治療は一定の進展を遂げていますが、特に再発または難治性の患者における長期生存率は依然として低いままです。そのため、新しい治療ターゲットとメカニズムの探索は、現在のAML研究における重要な方向性の一つです。

酸化還元恒常性（redox homeostasis）は、細胞代謝と生存において重要な役割を果たします。活性酸素種（ROS）の蓄積はDNA損傷や細胞死を引き起こしますが、抗酸化システム（グルタチオンやチオレドキシンシステムなど）はROSを除去することで細胞の正常な機能を維持します。チオレドキシン相互作用タンパク質（TXNIP）は、チオレドキシン（TRX）の内因性阻害剤であり、TRXの還元酵素活性を抑制することでROSの産生を増加させ、細胞の酸化還元バランスを破壊します。さらに、TXNIPはグルコース取り込みと代謝を抑制することで細胞の成長と生存を制限します。

WWP1はHECT型E3ユビキチンリガーゼであり、さまざまながんにおいて発がん作用を発揮することが示されています。しかし、AMLにおけるWWP1の作用メカニズムは完全には解明されていません。本研究は、WWP1がTXNIPを調節することでAML細胞の酸化還元状態と代謝に影響を与えるかどうかを探り、AMLにおける発がんメカニズムを明らかにすることを目的としています。

論文の出典

本論文は、イタリアのローマ大学Tor Vergata校実験医学部のFrancesca Bernassola教授のチームが主導し、中国の蘇州大学附属第一病院、イタリアのローマIDI-IRCCS研究所、ミラノのIFOM-ETS分子腫瘍学研究所などが協力して行われました。論文は2024年10月4日に『Molecular Oncology』誌にオンライン掲載され、DOIは10.¹⁰⁰²⁄₁₈₇₈-0261.13722です。

研究の流れと結果

1. WWP1の不活性化によりAML細胞中のROSレベルが上昇

研究ではまず、LC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析）を用いてWWP1が不活性化されたAML細胞中のグルタチオン（GSH）と酸化型グルタチオン（GSSG）の比率を測定しました。その結果、WWP1が不活性化されるとGSH/GSSG比率が有意に低下し、細胞内の酸化ストレスレベルが上昇していることが示されました。さらに、蛍光プローブH2DCFDAとMitoSOXを用いて細胞内およびミトコンドリア中のROSレベルを測定したところ、WWP1が不活性化されるとAML細胞中のROSレベル、特にミトコンドリアROSが顕著に増加することがわかりました。また、DNA酸化損傷マーカーである8-OHdGのレベルも有意に上昇し、WWP1の不活性化がDNA損傷を引き起こすことが示されました。

2. WWP1の不活性化はROSを介してDNA損傷を誘導

コメットアッセイ（comet assay）を用いてDNA鎖切断を測定したところ、WWP1が不活性化されたAML細胞ではDNA損傷が顕著に増加していました。同時に、DNA損傷マーカーであるγ-H2AXとATMのリン酸化レベルも有意に上昇していました。抗酸化剤であるN-アセチルシステイン（NAC）を処理すると、DNA損傷レベルが有意に低下し、WWP1の不活性化がROSを介してDNA損傷を誘導することが確認されました。

3. TXNIPはWWP1のユビキチン化の基質である

STRINGデータベースの分析により、研究チームはWWP1がTXNIPと相互作用する可能性があることを発見しました。さらに、免疫共沈降実験により、WWP1とTXNIPが直接結合することが確認されました。体内および体外でのユビキチン化実験により、WWP1がK48ユビキチン鎖を介してTXNIPのユビキチン化とプロテアソーム分解を促進することが示されました。WWP1の触媒活性変異体（C890A）はTXNIPのユビキチン化を誘導できず、WWP1の触媒活性がその機能に不可欠であることが示されました。

4. WWP1の不活性化によりTXNIPが安定化され機能が活性化

WWP1が不活性化されると、TXNIPのタンパク質レベルが顕著に上昇し、その半減期が延長しました。インスリンジスルフィド還元酵素実験により、WWP1が不活性化されるとTRXの酵素活性が有意に低下し、TXNIPの蓄積がTRXの抗酸化機能を抑制していることが示されました。TXNIP阻害剤であるTXNIP-IN-1またはカルシウムチャネル遮断剤であるベラパミルを処理すると、ROSレベルが有意に低下し、TXNIPがWWP1の不活性化による酸化ストレスにおいて重要な役割を果たしていることがさらに確認されました。

5. WWP1の不活性化はAML細胞のグルコース代謝に影響を与える

TXNIPはグルコース代謝の負の調節因子です。研究では、WWP1が不活性化されると、グルコーストランスポーターであるGLUT1、GLUT4、および解糖系の重要な酵素であるLDHAとLDHBのmRNAレベルが顕著に低下することがわかりました。Seahorseアナライザーを用いて解糖速度を測定したところ、WWP1が不活性化されるとAML細胞の解糖と酸化的リン酸化レベルがともに有意に低下し、ATP生成が減少することが示されました。TXNIPの遺伝子サイレンシングは、WWP1の不活性化によるグルコース取り込みと代謝の抑制を部分的に逆転させることができました。

結論と意義

本研究は、WWP1がTXNIPのユビキチン化分解を介してAML細胞の酸化還元状態とグルコース代謝を調節する分子メカニズムを明らかにしました。WWP1の過剰発現は、TXNIPの分解を加速することでTRXの抗酸化機能を強化し、細胞内ROSレベルを低下させることでAML細胞の生存と増殖を促進します。さらに、WWP1はTXNIPを調節することでグルコース代謝に影響を与え、AML細胞の成長と生存をさらに支持します。

この発見は、AML治療の新しい潜在的なターゲットを提供します。WWP1を抑制するか、TXNIPの機能を回復させることで、AML細胞の化学療法薬に対する感受性を高め、治療効果を向上させることができる可能性があります。今後の研究では、WWP1/TXNIP軸がAMLの化学療法耐性において果たす役割、および他のがんにおける潜在的な応用価値をさらに探求する必要があります。

研究のハイライト

1. 新しい分子メカニズム：WWP1がTXNIPのユビキチン化分解を介してAML細胞の酸化還元状態とグルコース代謝を調節する分子メカニズムを初めて明らかにしました。
2. 潜在的な治療ターゲット：WWP1/TXNIP軸は、特に化学療法耐性の患者において、AML治療の新しいターゲットとなる可能性があります。
3. 多層的な実験検証：体内外実験、ユビキチン化分析、メタボロミクスなど、さまざまな手法を用いてWWP1の機能とAMLにおける役割を包括的に検証しました。