内質網関連分解に標的となるポリシスチン2のミスセンス変異体の同定

学術的背景

多発性嚢胞腎（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD）は一般的な遺伝性疾患であり、最終的に末期腎不全を引き起こします。ADPKDは主にPKD1およびPKD2遺伝子の変異によって引き起こされ、それぞれがポリシスチン1（Polycystin 1, PC1）およびポリシスチン2（Polycystin 2, PC2）をコードしています。PC2は非選択性カチオンチャネルであり、疾患関連の変異は正常な機能、特にシグナル伝達や液体分泌を破壊します。PC1とPC2がADPKDの原因因子であることは知られていますが、ほとんどの疾患関連PC2ミスセンス変異がどのようにADPKDを引き起こすかのメカニズムは依然として不明です。特に、PC2ミスセンス変異がその折りたたみを損ない、内質網関連分解（Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation, ERAD）経路で分解されるかどうかについては十分に研究されていません。

本研究では、疾患関連のPC2ミスセンス変異がその折りたたみに影響を与えるかどうか、そしてそれがERAD経路で分解されるかどうかを調べることを目指しました。これを行うため、研究者たちは新しい酵母PC2発現システムを開発し、このシステムを使用してPC2の生合成プロセスを研究しました。また、2つの疾患関連PC2変異体（D511VおよびR322Q）の安定性、ユビキチン化レベル、および細胞表面局在について酵母とHEK293細胞で調査し、低温条件下でのこれらの変異体の折りたたみが修正可能かどうかを検討しました。

論文の出典

本論文はChristopher J. Guerriero、Marcelo D. Carattino、Katherine G. Sharp、Luke J. Kantz、Nikolay P. Gresko、Michael J. Caplan、およびJeffrey L. Brodskyによって共同執筆されました。著者たちはアメリカ合衆国のピッツバーグ大学生物科学科、ピッツバーグ大学医学部・細胞生物学部門、およびイェール大学細胞・分子生理学科に所属しています。本論文は2024年12月23日に初めて『American Journal of Physiology-Cell Physiology』誌に掲載され、DOIは10.1152/ajpcell.00776.2024です。

研究の流れと結果

1. 酵母PC2発現システムの開発

研究者たちはまず、PC2の生合成プロセスを研究するために新しい酵母PC2発現システムを開発しました。彼らは酵母においてN末端にトリプルHAタグを持つヒトPC2を発現させ、低コピー（CEN）および高コピー（2μ）の発現ベクターを構築しました。異なるコピー数のベクターが酵母の成長に与える影響を比較したところ、高コピーベクターは酵母の成長を遅らせることがわかりました。そのため、後続の実験では主に低コピーベクターを使用しました。

PC2の発現と局在を確認するため、研究者たちはPC2の糖鎖修飾を分析しました。その結果、PC2は酵母とHEK293細胞の両方で糖鎖修飾を受け、エンドグリコシダーゼH（Endo H）処理によりPC2の糖鎖修飾形式が除去されることから、PC2が正しく小胞体（ER）に位置し、ER膜に挿入されていることが示されました。さらに、ライブセル顕微鏡観察により、PC2-GFP融合タンパク質が酵母とHEK293細胞の両方で主にERに局在することが確認されました。

2. PC2変異体の安定性とERAD標的化

研究者たちは最初に野生型PC2と2つの疾患関連変異体（D511VおよびR322Q）の酵母における恒常的な発現レベルを比較しました。その結果、D511V変異体の発現レベルは大幅に低下している一方で、R322Q変異体の発現レベルは野生型PC2と類似していることがわかりました。さらに、シクロヘキシミド（Cycloheximide）追跡実験により、D511V変異体は酵母内で不安定であるのに対し、R322Q変異体の安定性は野生型PC2と類似していることが明らかになりました。

D511V変異体がERAD経路で分解されているかどうかを調べるため、研究者たちはプロテアソーム阻害剤MG132を使用して処理を行いました。その結果、MG132処理はD511V変異体を有意に安定化させ、これが確かにERAD経路で分解されていることを示しました。さらに、ユビキチン化実験により、D511V変異体の酵母におけるユビキチン化レベルは野生型PC2およびR322Q変異体よりも有意に高いことがわかりました。

3. 酵母におけるPC2機能活性の検出

PC2が酵母で機能的なチャネルを形成するかどうかを検出するため、研究者たちは酵母の成長に基づく定量的検出方法を使用しました。彼らは内在性カリウムトランスポーター（Trk1およびTrk2）を欠損した酵母株を使用し、低カリウム培地でPC2の機能を検査しました。その結果、野生型PC2は酵母の低カリウム培地での成長をサポートできませんでしたが、PC2の機能強化変異体（PC2_2a）は酵母の成長をサポートしました。しかし、D511VおよびR322Q変異体はPC2_2aのバックグラウンドでも酵母の成長をサポートできず、これらの変異体がチャネル機能を失っていることを示しました。

4. HEK293細胞におけるPC2変異体の研究

酵母での結果が高等真核細胞にも適用可能かどうかを検証するため、研究者たちはHEK293細胞でPC2-GFPとその変異体を発現させました。その結果、D511VおよびR322Q変異体のHEK293細胞における恒常的な発現レベルはいずれも有意に低下していました。さらに、シクロヘキシミド追跡実験により、これらの変異体はHEK293細胞においても不安定であり、そのユビキチン化レベルは野生型PC2よりも有意に高いことがわかりました。

研究者たちはまた、HEK293細胞表面でのPC2変異体の局在を細胞表面ビオチン化実験によって検出しました。その結果、D511VおよびR322Q変異体の細胞表面への局在は有意に減少しており、これらの変異体の折りたたみ欠陥が細胞表面への輸送に影響を与えていることが示されました。しかし、低温（26°C）条件下では、これらの変異体の総発現レベルと細胞表面局在は部分的に回復し、その折りたたみ欠陥が低温で修正可能であることを示唆しました。

5. アフリカツメガエル卵母細胞におけるPC2機能の検出

PC2変異体の機能をさらに研究するため、研究者たちはアフリカツメガエル卵母細胞でPC2の機能強化変異体（F604P）および疾患関連変異体（D511VおよびR322Q）を発現させ、二電極電圧クランプ（Two-Electrode Voltage Clamp, TEVC）実験で電流を測定しました。その結果、D511V変異体は卵母細胞で完全にチャネル機能を喪失していた一方で、R322Q変異体の電流はF604P変異体よりも有意に低いものの、未注入の対照群よりも高いことがわかりました。この結果は、R322Q変異体の折りたたみ欠陥が低温条件下で部分的に修正され、一部のチャネル機能が回復することを示唆しています。

結論と意義

本研究は、特定のPC2ミスセンス変異がタンパク質の折りたたみ欠陥を引き起こし、ERAD経路で分解されることを示しています。研究者たちはPC2の生合成と機能を研究するための新しい酵母PC2発現システムを開発し、D511V変異体が酵母とHEK293細胞の両方でERAD経路で分解されることを発見しました。さらに、R322Q変異体はHEK293細胞でERAD標的の特性を示しましたが、酵母では相対的に安定でした。低温条件下では、これらの変異体の折りたたみと細胞表面局在が部分的に回復し、その折りたたみ欠陥が薬物介入によって修正可能であることを示唆しています。

本研究のハイライトは、PC2の機能喪失変異体を迅速にスクリーニングおよび同定するための新しい酵母モデルシステムの開発であり、特定のPC2ミスセンス変異がERAD経路で分解されるメカニズムを明らかにしました。さらに、低温がPC2変異体の折りたたみ欠陥を部分的に修正できることを示し、ADPKD治療戦略の開発に新たな方向性を提供しました。

研究価値

本研究は、PC2ミスセンス変異がERAD経路で分解されるメカニズムを明らかにするだけでなく、ADPKD治療のための潜在的な新戦略を提供しました。酵母モデルシステムの開発により、研究者たちはPC2の機能喪失変異体を迅速にスクリーニングおよび同定し、将来の薬物開発に重要な実験プラットフォームを提供しました。さらに、低温がPC2変異体の折りたたみ欠陥を部分的に修正できることを示し、ADPKD向けのタンパク質折りたたみ修正剤の開発に理論的な基盤を提供しました。

本研究は、PC2ミスセンス変異の病原性メカニズムを理解するための新しい洞察を提供し、ADPKD治療戦略の開発に新たな方向性を切り拓きました。