CRISPR依存スクリーニングによって原代造血幹細胞でIDH2およびTET2変異型の特異的感受性としてKDM3Bが同定された

背景と研究意義

クローン性造血（Clonal Hematopoiesis, CH）は、特定の変異を持つ造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）によって引き起こされる遺伝子的に異なるサブ群細胞の異常な増殖を指す。この現象は60歳以上の人々の間で非常に一般的であり、20%以上の人口に影響を与える。CHは急性骨髄性白血病（AML）への悪性転化リスクの増加に関連し、さらに全原因の死亡率や心血管疾患などの年齢関連疾患とも関連している。以前の遺伝学研究はCHに関連する遺伝子変異を同定したが、CHにおける治療ターゲットを特定することは依然として困難である。これは主に、初代造血幹細胞（HSPC）の研究に適したin vitroプラットフォームの欠如による。この研究では、著者はHSPCと骨髄内皮細胞（Bone Marrow Endothelial Cells, BMECs）の共培養システムを利用し、CRISPR/Cas9スクリーニングを行い、IDH2およびTET2変異HSPCにおけるヒストン脱メチル化酵素KDM3Bの重要な役割を同定した。

論文出典

この研究は、Michael R. Waartsらの研究者によって共同執筆され、著者はそれぞれMemorial Sloan Kettering Cancer Center、Dana-Farber Cancer Institute、Icahn School of Medicine at Mount Sinai、Cincinnati Children’s Hospital Medical Centerなどの機関から来ている。本研究はCancer Discovery誌に発表された。

研究方法詳細

実験フロー

1. プラットフォームの確立：まず、研究者はHSPCとBMECの共培養システムを確立した。このシステムでは、BMEC上で長期間HSPCを維持拡大することによって、HSPCの移植能力を保持しながら全系統の骨髄系細胞を生成することができる。
2. 動物モデルと遺伝的背景：以前報告された遺伝子型モデルを使用し、dnmt3aflox/flox、asxl1flox/flox、tet2flox/flox、idh2r140qflox/+マウスを含む。これらのマウスをHSC特異的Creリコンビナーゼおよび蛍光レポーター遺伝子（tdT+）と交配した。
3. 競合培養実験：競合培養実験を通じて、異なる血液生成細胞系列における野生型および変異型HSPCのパフォーマンスを評価した。
4. in vitroおよびin vivo検証：変異HSPCに対してin vitroでCRISPR/Cas9遺伝子編集および小分子薬物介入を行い、移植実験を通じてin vivoで発見された遺伝子依存性を検証した。
5. CRISPRスクリーニング：表現遺伝子修飾酵素に対するCRISPRライブラリーを用いて大規模なスクリーニングを実施し、異なる遺伝子変異型HSPCにおける依存性遺伝子を同定した。

実験詳細

研究者は997個のガイドRNA（single guide RNA, sgRNA）で構成されるCRISPRライブラリーを使用し、191個の遺伝子をスクリーニング。遺伝子的操作により、適切な感染条件を決定し、細胞の活力と増殖能力を維持した。スクリーニングプロセスはHSPCを感染させ、BMECと共培養してからDNAシーケンシングを行い、sgRNAの代表性を評価する。

次に、dnmt3a-/-, asxl1-/-, tet2-/-およびidh2r140q型HSPCを用いてCRISPRスクリーニングを行い、野生型および変異型HSPC間の遺伝子依存性の差異をスコアリングシステムで評価した。これらの遺伝子の中で、KDM3BはIDH2r140qおよびTET2-/-細胞において顕著な依存性を示し、in vivoでのさらなる検証でも同様の遺伝子依存性結果を示した。

結果詳細

1. KDM3Bのin vitroおよびin vivo依存性：KDM3B欠損はIDH2r140qおよびTET2-/-細胞の競争力を顕著に低下させ、KDM3Bがこれらの変異HSPCの特異的依存遺伝子であることが示された。in vivo実験では、KDM3B欠損が変異細胞の生存能力および自己更新能力を大幅に弱体化させた。
2. ヒトCH変異細胞での依存性：ヒトCH変異細胞においても、KDM3B欠損は特にTET2変異HSPCで類似した依存性を示した。これらの結果は、一連の競合培養およびクローン形成実験によって検証された。
3. メカニズム研究：研究は、IDH2変異によって生じる2-HG産物がKDM3B依存性の主要因であり、KDM3B酵素活性が変異細胞の生存に重要であることを示した。KDM3Bと変異IDH2はエピジェネティックレベルでいくつかの重要な遺伝子を協調的に調節しており、これには細胞因子受容体遺伝子が含まれ、これらの遺伝子の変異細胞における転写出力を強化した。

結論および研究の価値

本研究の重要な発見の一つは、KDM3Bというヒストン脱メチル化酵素がIDH2およびTET2変異HSPCにおける特異的依存性を有することを同定したことである。研究は、KDM3B酵素活性がIDH2変異細胞の生存にとって極めて重要であることを示し、潜在的な治療ターゲットを明示した。さらに、研究は、IDH2変異細胞内の細胞因子受容体シグナルのダウンレギュレーションを発見し、これがCHおよびAML患者に対する新しい治療方法を提供すると述べている。

研究のハイライト

1. 変異特異的遺伝子依存性：特定の変異型HSPCにおいてKDM3Bが重要な役割を果たすことを同定し、標的治療の新しい方向性を提供。
2. エピジェネティックなメカニズムの探求：KDM3BおよびIDH2変異がエピジェネティックレベルで協調作用することを解明し、これらのメカニズムに対する理解を深めた。
3. in vitroプラットフォームの開発および応用：研究は効果的なin vitroプラットフォームを開発し、関連遺伝子依存性を迅速かつ正確にスクリーニングすることができ、将来の研究に対して強力なツールを提供。