ロスマリン酸による髄芽腫細胞での生存率、増殖、および幹性の調節：HDACおよびEGFRの関与

小児髄芽腫（Medulloblastoma、MB）は最も一般的な悪性小児脳腫瘍であり、その独特な分子的および臨床的特性により、この種の腫瘍の治療は常に臨床研究の焦点となっています。現在の治療法は主に最大限の外科的切除、放射線療法、化学療法を含みますが、これらの治療法はしばしば患者の長期的な生活の質の低下を引き起こし、認知、運動、神経精神的な欠陥を含みます。したがって、腫瘍に効果的に対抗し、同時に患者の生活の質を維持する新しい治療薬を見つけることが急務となっています。

このような背景の下、著者チームは植物由来の化合物であるロズマリン酸（Rosmarinic Acid、RA）に関する一連の研究を行いました。ロズマリン酸は、がんを含む多くの疾患に対して一定の効果があることが研究で示されています。本研究では、著者らは初めてロズマリン酸の髄芽腫に対する作用メカニズムを探究しました。

研究チームと論文発表

この論文はAlice Laschuk Herlinger、Gustavo Lovatto Michaelsen、Marialva Sinigagliaなど多くの研究者によって共同執筆されました。研究所属機関にはブラジルのリオグランデ連邦大学がん・神経生物学研究所、ブラジル小児腫瘍・小児がん生物学国立科学技術研究所、ブラジル北リオグランデ連邦大学バイオインフォマティクス大学院プログラムなどが含まれます。論文は2023年9月23日に「Neuromolecular Medicine」誌に掲載されました。

研究背景と目的

本研究は、2つのヒト髄芽腫細胞株（DAOYとD283）におけるロズマリン酸の作用とその潜在的な分子メカニズムを探ることを目的としています。DAOY細胞株はSONIC HEDGEHOG（SHH）サブグループを、D283細胞株はグループ3分子サブグループを代表しています。

研究プロセス

1. 細胞培養

DAOY（HTb186™）とD283（HTb185™）細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手し、その同一性と汚染がないことを確認しました。細胞は2%(W/V) L-グルタミンと10%(V/V) 胎児ウシ血清（FBS）を含む低グルコースDulbecco改変Eagle培地（DMEM）で培養されました。

2. 薬物処理

ロズマリン酸（RA）はSigma-Aldrich社から購入し、100mMの濃度に希釈しました。ジメチルスルホキシド（DMSO）を溶媒として使用して希釈し、実験前に新鮮に調製しました。

3. 細胞生存率評価

トリパンブルー細胞計数法を用いて細胞生存率を評価しました。異なる濃度のロズマリン酸で48時間処理した後、細胞生存率を計算し、非線形回帰によりIC50値を推定しました。

4. コロニー形成能力試験

細胞をロズマリン酸で48時間処理した後、低密度で再培養し、形成されたコロニーの数と面積を観察しました。

5. 細胞増殖評価

12日間の累積集団倍加（CPD）を推定することで、ロズマリン酸の細胞増殖への影響を評価しました。

6. ニューロスフェア形成評価

ニューロスフェア形成実験を用いてがん幹細胞（CSC）の増殖能力を評価し、ロズマリン酸処理後のニューロスフェア面積とCSCマーカーの発現を含みました。

7. 定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）

細胞の総RNAを抽出し、qPCRを用いて標的遺伝子のmRNAレベルを測定しました。

8. ウェスタンブロット法

ロズマリン酸で48時間処理した後、ウェスタンブロット法を用いて標的タンパク質の発現レベルを評価しました。

9. 生存分析

公開遺伝子発現データセットを使用して、髄芽腫患者の全生存率と分子サブグループを分析しました。

10. データ統計分析

多様な統計分析方法を用いて実験結果の有意性を検証しました。

主な結果

1. 細胞株に対するロズマリン酸の細胞毒性：ロズマリン酸はDAOYとD283細胞の生存率を有意に減少させ、それぞれのIC50は168μMと334μMでした。

2. コロニー形成能力：ロズマリン酸はDAOY細胞のコロニー形成面積を有意に減少させましたが、D283細胞には顕著な影響を与えませんでした。

3. 細胞増殖：DAOY細胞のCPDはロズマリン酸処理後に有意に減少しましたが、D283細胞での増殖への影響は小さかったです。

4. ニューロスフェア形成とCSCマーカー：ロズマリン酸は両細胞株で形成されたニューロスフェアの面積を有意に減少させ、CSCマーカー（PROM1/CD133）の発現も下方制御しました。

5. 分子メカニズム：DAOY細胞において、ロズマリン酸はHDAC1の発現を下方制御し、H3K9AcとCDKN1A/P21の発現を増加させ、SOX2を抑制し、EGFRとERK/AKTシグナル経路の活性を減少させることで、細胞周期停止と細胞生存率の低下を引き起こしました。

結論

本研究は初めて、ロズマリン酸が髄芽腫細胞に対して細胞毒性と細胞静止効果を持ち、がん幹細胞の特性を抑制することを明らかにし、健康な脳細胞に対しては毒性がないことを示しました。ロズマリン酸はHDACとEGFRシグナル経路に影響を与えることで、MB細胞の増殖と幹細胞性を制御します。総じて、ロズマリン酸のMBに対する潜在的治療薬としての研究価値と応用の見通しはさらなる探究に値します。

意義と価値

本研究は、ロズマリン酸が髄芽腫に対して潜在的な抗がん効果を持つことを確認し、HDACとEGFRシグナル経路の抑制を通じて細胞周期停止と細胞死を引き起こす分子メカニズムを提案しました。さらに、ロズマリン酸は他のがん基礎研究および前臨床研究において低毒性と高効能を示しており、新しい抗腫瘍薬となる可能性も高めています。

本研究は、将来の薬物開発と臨床応用に新しいアイデアとデータサポートを提供しており、特により安全で効果的な腫瘍治療法を見つけたいという背景の下、ロズマリン酸の研究はさらに注目を集めることになるでしょう。