神经母细胞瘤的肿瘤微环境介导的耐药性研究

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神经母细胞瘤 耐药性 肿瘤微环境 TGF-β1 核因子κB 治疗

背景

研究背景：内在和外在的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）因素均会导致治疗抗药性。本文揭示了TME中产生的转化生长因子（Transforming Growth Factor, TGF）-β1增加了神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）细胞的药物抗性。抗药性是癌症治疗失败的主要原因，通常由于癌细胞固有的基因组和染色体不稳定性以及选择压力和肿瘤异质性相关的表观遗传改变导致。另外，抗药性也可能由外部因素（如异常的血流和TME的影响）导致，称之为环境介导的药物抗性（Environment-Mediated Drug Resistance, EMDR）。

神经母细胞瘤是小儿最常见的颅外实体瘤，具有高复发风险。大约50%的NB患儿被归类为高风险癌症。尽管采用了手术、髓细胞消融化疗、放射治疗和免疫治疗的综合治疗，超过50%的患儿仍死于难治性或复发性疾病。

研究来源

本文的作者包括Kévin Louault、Laurence Blavier、Men-Hua Lee、Rebekah J. Kennedy、G. Esteban Fernandez、Bruce R. Pawel、Shahab Asgharzadeh和Yves A. Declerck。他们分别隶属于位于洛杉矶儿童医院和南加州大学的癌症和血液疾病研究中心、The Saban Research Institute、Pathology和Laboratory Medicine以及Biochemistry and Molecular Medicine系。论文发表在《British Journal of Cancer》期刊，在线发表日期为2024年5月28日。

研究流程详解

  1. 细胞系和人类单核细胞的准备：

    • 使用的NB细胞系包括CHLA-255、SK-N-AS、SK-N-SH、CHLA-136、SK-N-BE(2)，其中包括表达和未经修饰的MYCN和C-MYC。NB细胞系均从洛杉矶儿童医院获取和培养。
    • MSC从健康捐赠者的骨髓中获取并培养。MN从健康献血者的外周血中分离并用于实验。

  2. 体外共培养实验：

    • 使用Transwell进行共培养实验。双重共培养的NB:MN比例为1:1，NB:MSC比例为4:1；三重共培养的比例为4:4:1（NB:MN:MSC）。
    • 不同细胞组分分别进行培养，不同药物或人重组TGFB1的浓度进行处理，实验时间跨度从10分钟到3天不等。

  3. 药物敏感性测试：

    • 在各种细胞共培养设置下，分别测试NB细胞对多柔比星（Dox）和依托泊苷（Etop）的敏感性，使用台盼蓝排除法测定存活细胞。

  4. 蛋白质检测与分析：

    • 利用Western Blot分析NB细胞裂解物中多种蛋白质的表达。
    • 进行免疫共沉淀（Co-IP）实验以识别蛋白复合物。
    • 核提取实验以评估核蛋白和细胞浆蛋白的分离和表达。

  5. 基因敲除实验：

    • 通过RNA干扰（RNAi）方法进行基因敲除实验，检测基因敲除对靶蛋白表达和细胞抗药性的影响。

  6. 免疫组化（Immunohistochemistry）与动物模型实验：

    • 检测化疗药物对移植模型NB肿瘤的敏感性，使用免疫缺陷小鼠进行体内药物反应实验。
    • 免疫组化分析不同NB肿瘤组织中p-NF-κB的表达。

研究结果详解

  1. TGF-β1诱导的EMDR：

    • 结果显示，与单独培养的NB细胞相比，在与TME细胞共培养72小时后，NB细胞对Dox和Etop的IC50显著增加。Western Blot分析显示，TME细胞可增加多药耐药蛋白MRP1和MDR1以及生存蛋白Bcl-XL、Mcl-1和Survivin的表达。
    • 使用TGF-βR1/ALK5抑制剂Galunisertib能显著恢复NB细胞的药敏性，证实了TGF-β1在EMDR中的作用。

  2. TGF-β1激活的NF-κB：

    • 在NB细胞中，TGF-β1不仅诱导了Smad2的磷酸化，还诱导了NF-κB p65的磷酸化和核转位。
    • 使用NF-κB核转位抑制剂JSH-23能抑制TGF-β1处理的NB细胞中多药耐药蛋白和生存蛋白的上调，证实了NF-κB在TGF-β1诱导的药物抗性中的核心作用。

  3. NF-κB激活的TAK1依赖性：

    • TAK1抑制剂NG25能阻断TGF-β1诱导的NF-κB p65磷酸化，证实了TAK1非经典途径在TGF-β1信号中的作用。

  4. 上调IL-6家族细胞因子：

    • TGF-β1诱导IL-6、MCP-1、LIF和OSM的产生，这些细胞因子的上调依赖于NF-κB p65的活化。
    • IL-6通过激活STAT3促进生存蛋白如Bcl-XL的表达，进一步证明了TGF-β1通过TAK1/NF-κB/Smad2途径诱导的耐药性的复杂机制。

  5. 体内验证：

    • 小鼠移植模型实验中，联合使用Galunisertib和Etop能逆转NB肿瘤的耐药性。这些数据提供了对TGF-β1相关途径在体内药物抗性中的重要证据支持。

结论和意义

本文通过鉴定TGF-β1/TAK1/NF-κB/Smad2信号通路在NB细胞中与TME中细胞相互作用导致的药物耐药机制，为TGF-β1在肿瘤进展和治疗耐药中的贡献提供了新的见解。这一发现为克服EMDR提供了一个潜在的治疗靶点。明确TME中TGF-β1、NF-κB活动高的NB肿瘤有助于识别高药物耐药风险的肿瘤。此外，结合化疗或免疫治疗的TGF-β信号抑制剂在治疗这些高风险肿瘤中可能具有重要的临床应用价值。

本文的发现强调了TGF-β1在NB细胞与TME相互作用中驱动药物耐药性的关键作用，提供了重新评估TGF-β1和NF-κB在NB进展中的意义。