パルミトイル基転移酵素によるFoxP3の独特なパルミトイル化は制御性T細胞の機能を調節する

2024-08-01 Thu
Foxp3の独特なパルミトイル化は、パルミトイル転移酵素を介してTregsの機能を調節する制御性T細胞(Tregs)は、体の免疫恒常性を維持し、過剰な免疫応答を防ぐ上で重要な役割を果たしています。免疫反応を抑制する重要な役割として、Tregsは免疫寛容の維持に寄与し、自己免疫疾患の発生を防ぎます。しかし、腫瘍微小環境(TME)では、Tregsは様々なメカニズムを通じてエフェクター細胞の活性を弱め、腫瘍の発生と進行を促進します。Foxp3(フォークヘッドボックスタンパク質P3)はTregsの重要な転写因子であり、その発現はTregsの発達と機能に不可欠です。Foxp3は、リン酸化、ユビキチン化、糖鎖付加、アセチル化など、多くの翻訳後修飾によって調節されることが知られていますが、パルミトイル化という翻訳後修飾が生理的条件やTMEでFoxp3の機能を調節するかどうかはまだ不明です。
研究背景と目的パルミトイル化は、16個の炭素からなるパルミトイル基をタンパク質のシステイン残基にチオエステル結合で付加する可逆的な脂質翻訳後修飾です。パルミトイル化は、タンパク質の細胞内局在、タンパク質間相互作用、安定性、シグナル伝達活性の調節に重要です。最近の研究では、パルミトイル化プロセスにおける主要な役割が特定され、特にAsp-His-His-Cys(DHHC)モチーフを含む24種類のパルミトイル転移酵素ファミリーが、標的タンパク質へのパルミトイル基の付加を触媒することが分かっています。さらに、APT1/2、PPT1/2、ABHD17A/B/Cなど、複数の脱パルミトイル化酵素の発見により、パルミトイル基の除去プロセスが明らかになりました。パルミトイル化と脱パルミトイル化のダイナミックなバランスは、タンパク質機能と細胞シグナリングの調整に重要です。本研究は、Foxp3のパルミトイル化とその抗腫瘍免疫応答への影響を調べることを目的としています。
研究チームと発表情報この研究は、新郷医学院第二附属病院、精神・神経科学研究所、河南分子診断・実験室医学協同イノベーションセンターなどの複数のチームによって共同で実施されました。主な著者にはBinhu Zhou、Mengjie Zhang、Haoyuan Ma、Ying Wang、Eryan Kongらが含まれます。この研究成果は2024年5月8日に「Cellular & Molecular Immunology」誌に発表されました。
研究プロセスと実験方法研究ではまず、HEK293T細胞でFoxp3-Mycを過剰発現させ、ABE(アセチル-ビオチン交換)とAcyl-RAC(アシル樹脂支援キャプチャー)実験を用いて、in vitroでのFoxp3のパルミトイル化状態を確認しました。結果は、Foxp3が実際にパルミトイル化されていることを示しました。次に、C57BL/6マウスのリンパ節からタンパク質を抽出し、ABE検出を行い、Western blot分析の結果、リンパ節でもFoxp3のパルミトイル化が存在することが示されました。
Foxp3の特定のパルミトイル化部位を特定するために、研究チームはFlagタグ付きFoxp3タンパク質を設計・発現させ、質量分析を行いました。結果、Foxp3はCys204、Cys218、Cys280、Cys281、Cys424の5つのシステイン残基でパルミトイル化されており、各パルミトイル化イベントによってタンパク質の分子量が238 Da増加することが示されました。さらなる検証実験では、HEK293T細胞で様々なFoxp3変異体を発現させ、Acyl-RACを用いてパルミトイル化レベルを測定しました。結果、これらのシステイン残基をアラニンに置換すると、Foxp3のパルミトイル化レベルが減少し、特に5つのシステイン残基を同時に変異させた5CA変異体ではパルミトイル化がほぼ完全に消失しました。
次に、研究では共免疫沈降(Co-IP)実験を用いて、Foxp3と複数のパルミトイル転移酵素との相互作用を分析し、Foxp3とDHHC2、DHHC3、DHHC7、DHHC13、DHHC17、DHHC19、DHHC23との物理的相互作用を確認しました。定量リアルタイムPCR分析(qRT-PCR)により、これらのパルミトイル転移酵素のうち、DHHC2、DHHC3、DHHC7が脾臓および腫瘍組織由来のTregsで豊富に発現していることが分かりました。
これらのパルミトイル転移酵素がFoxp3のパルミトイル化においてどのような役割を果たすかをさらに探るため、研究チームは複数の実験を行いました。Co-IPとAcyl-RAC分析の結果、DHHC2、DHHC3、またはDHHC7の単独過剰発現により、Foxp3のパルミトイル化レベルが顕著に増加することが示されました。
研究結果と結論Foxp3のパルミトイル化のin vivoでの機能をさらに調べるため、研究チームはDHHC2、DHHC3、DHHC7のノックアウトマウスを作製しました。フローサイトメトリーのデータは、DHHC2のノックアウトがリンパ節と脾臓でFoxp3タンパク質の発現を減少させることを示しました。CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、研究チームは3種類のパルミトイル転移酵素をさらに分析し、DHHC3またはDHHC7のノックアウトもTregsにおけるFoxp3タンパク質の発現レベルを有意に低下させることを示しました。
最終的に、研究チームはFoxp3-Creマウスでこの現象を確認し、Foxp3のパルミトイル化がTMEにおけるTregsの抑制機能に重要な役割を果たすことを証明しました。YUMM3.3メラノーマ細胞を腫瘍内注射することで、研究チームはDHHC2を特異的に欠損したマウスが腫瘍成長の抑制を示し、腫瘍浸潤TregsにおけるFoxp3の発現が顕著に減少することを発見しました。
研究の意義と価値この研究は、Foxp3のパルミトイル化ダイナミクスとその抗腫瘍免疫における重要な役割を初めて明らかにしました。複数のパルミトイル転移酵素によるFoxp3機能の調節を分析することで、研究はTregs制御を標的とした免疫療法開発への新しいアプローチを提供しました。
この研究結果は、Foxp3とTregsに対する理解を深めるだけでなく、将来の腫瘍免疫回避メカニズムに関する研究にも重要な参考となります。研究で使用された方法論(質量分析、CRISPR/Cas9遺伝子編集など)は、科学的革新と実験設計の高度な融合を示しており、その研究結論は今後の研究や臨床応用において幅広い可能性を持っています。