科学研究報告：薬物治療によるCollapsin Response Mediator Protein 2リン酸化抑制を通じた正常眼圧緑内障マウスモデルの網膜神経節細胞死の緩和

背景紹介

正常眼圧緑内障（Normal Tension Glaucoma, NTG）は緑内障ファミリーの中の進行性神経変性疾患の一つです。通常、緑内障の発症は眼圧（Intraocular Pressure, IOP）レベルの上昇と関連していますが、NTGは正常眼圧下でも網膜神経節細胞（Retinal Ganglion Cells, RGC）の変性、軸索の喪失、および視神経の損傷が発生します。NTGは開放隅角緑内障の一つのサブタイプとして、その病理メカニズムが広く注目されており、特にグルタミン酸興奮毒性と酸化ストレスが重要です。NTG研究において、これらの病因因子とRGCのアポトーシスの関係を探ることは、効果的な治療法の開発に重要な意味を持ちます。

最近の研究では、Collapsin Response Mediator Protein 2（CRMP2）のリン酸化を抑制することで、NTGマウスモデルにおけるRGCの死を顕著に減少させることができることが示されています。この研究は、二つの天然化合物Huperzine A（HupA）とNaringenin（Nar）のCRMP2リン酸化抑制効果を評価し、これらがN-メチル-D-アスパラギン酸（N-Methyl-D-Aspartate, NMDA）による興奮毒性やGlast変異マウスにおけるRGCの死を軽減できるかどうかを探究することを目的としています。

ソースと著者情報

この論文はYuebing Wang、Musukha Mala Brahma、Kazuya Takahashi、Alessandra Nolia Blanco Hernandez、Koki Ichikawa、Syuntaro Minami、Yoshio Goshima、Takayuki HaradaとToshio Ohshimaなどの科学者によって共同執筆され、早稲田大学、奈良県立医科大学、横浜市立大学大学院医学研究科、東京都医学総合研究所などの研究機関から発表されました。論文は2024年に「Neuromolecular Medicine」誌に掲載されました。

研究ワークフロー

研究モデルと実験デザイン

1. 実験動物: マウス実験は早稲田大学動物管理使用委員会の承認を得ています。マウスは12時間の明/暗サイクルで飼育され、自由に餌と水にアクセスできるようにしました。実験には野生型とGLAST+/−およびCRMP2 KI/KI遺伝子改変マウスが含まれます。

2. 眼内注射: マウスは10-16週齢でジエチルエーテル麻酔下で、20 nmol NMDAを眼内注射して生体内で興奮毒性を誘導しました。対照群には同量のPBSを注射しました。

3. 薬物投与戦略: HupA（0.7 mg/kg）とNar（200 mg/kg）は混合食を通じて経口投与されました。実験群のマウスは眼内注射の前日から HupAとNarの投与を受け始め、異なる実験での投与期間は様々でした。

4. 組織学的分析:

   • 免疫組織化学: 4% PFAで灌流固定した伸展網膜サンプルを用いて免疫染色分析を行いました。
   • H&E染色: マウスをジエチルエーテルで麻酔し、固定した網膜サンプルをH&E染色してRGCの損失と内網膜層（Inner Retinal Layer, IRL）の厚さを分析しました。

5. 統計分析: データは平均±標準誤差で表示しました。2群間の比較にはStudent’s t-testを、多群間比較にはANOVAとTukey’s事後検定を使用しました。分析にはGraphPad Prismソフトウェアを使用しました。

実験結果とデータ分析

1. 薬物投与によるNMDA誘導マウス網膜CRMP2リン酸化の抑制

   • 免疫染色により、薬物投与群マウスの網膜でpCRMP2シグナルの減弱が観察され、HupAとNarがNMDA誘導CRMP2リン酸化を顕著に抑制したことが示されました。
   • 定量分析では、NMDA処理群と比較して、HupAとNar処理を受けたマウスのRGCにおけるpCRMP2陽性細胞が有意に減少しました。

2. NMDA誘導モデルにおけるRGC変性とIRL菲薄化の減少

   • HupAとNar処理を受けたマウスは、網膜RGCの生存率増加とIRL厚の減少抑制を示しました。例えば、H&E染色の結果は、NMDA処理マウスにおいて、Nar処理を受けたマウスがより高いRGC生存率とIRL厚を持つことを示しました。

3. Glast変異マウスモデルにおける薬物投与によるCRMP2リン酸化の抑制

   • 10週齢のGlast+/−マウス網膜の免疫染色により、野生型マウスと比較して、Glast+/−マウスのRGCでCRMP2リン酸化レベルが有意に上昇していることが分かりました。しかし、HupAとNar処理後、Glast+/−マウスのCRMP2リン酸化シグナルは有意に減少しました。

4. Glast変異マウスにおけるHupAとNarによるRGC変性の抑制

   • HupAとNar処理により、5週齢と10週齢のGlast+/−マウス両方でRGC喪失の減少とIRL構造の完全性向上が見られました。例えば、H&E染色分析では、対照群と比較して、薬物処理群マウスのRGC数が有意に増加し、IRL厚が有意に増加しました。

5. Glast変異マウスにおけるHupAとNarによる酸化ストレスの低減

   • 免疫染色により、未処理のGlast+/−マウスのRGC層で4-HNE（酸化ストレスマーカー）の発現レベルが有意に上昇していることが示されましたが、HupAとNar処理後、4-HNEレベルは有意に低下しました。
   • これらの結果は、HupAとNarがCRMP2リン酸化の抑制だけでなく、酸化ストレスの減少を通じてもGlast変異マウスのRGCを変性から保護することを示しています。

結論

研究は、HupAとNarがCRMP2リン酸化を抑制することで、NMDA注射モデルとGlast変異マウスモデルの両方でRGCの死と網膜変性を顕著に減少させることを示しました。さらに、両薬物は酸化ストレスを著しく減少させる効果も示しました。これらの発見はNTGの治療に新たな視点を提供し、HupAとNarが将来のNTG治療の潜在的な薬物となる可能性を示唆しています。

研究のハイライト

1. 薬物の多重作用メカニズムの発見: HupAとNarはCRMP2リン酸化の抑制だけでなく、酸化ストレスの低減を通じてもRGCを保護します。
2. 複数の実験モデルでの検証: 研究は二つの異なるNTGマウスモデルを使用し、HupAとNarが多様な状況下で効果的であることを証明しました。
3. 治療の手がかりの提供: 本研究はNTGの新たな治療の手がかりを提供し、将来の効果的な神経保護剤開発のための基礎データを支持しています。

将来の展望

本研究はいくつかの積極的な結果を得ましたが、薬物治療によるNTGの具体的なメカニズムはさらなる探求が必要です。さらに、HupAとNarの剤型、有効性、安全性、生物学的利用能を改善するための将来の研究が、臨床応用の実現に向けて必要とされています。