前列腺癌中循环肿瘤细胞和肿瘤组织的高多重表征与单细胞和空间分析
前列腺癌（Prostate Cancer, PC）是全球男性中第三大常见的实体肿瘤，2020年估计有140万新发病例。随着全球人口老龄化的加剧，前列腺癌的发病率预计将持续上升，到2040年可能达到290万例。尽管治疗手段不断进步，但晚期前列腺癌的治疗仍然面临巨大挑战，尤其是耐药性的出现。雄激素受体（Androgen Receptor, AR）信号通路的失调在前列腺癌的发展和进展中起关键作用，因此，雄激素剥夺疗法（Androgen Deprivation Therapy, ADT）是晚期前列腺癌的主要治疗手段。然而，几乎所有患者最终都会对ADT产生耐药性，发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer, CRPC）。此外，AR信号通路的异常（如AR基因扩增、突变和AR剪接变体AR-V7的表达）以及神经内分泌转分化等AR非依赖的耐药机制也在逐渐增多。
目前，临床上缺乏基于生物标志物的个体化治疗推荐方案，且缺乏有效的工具来监测患者的耐药性。液体活检（Liquid Biopsy）作为一种微创的疾病监测手段，近年来受到广泛关注。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）是液体活检中的主要分析物。然而，同时检测多种耐药机制和预测性生物标志物仍然是一个重大挑战。此前，研究团队已经展示了基于mRNA的原位Padlock探针杂交技术在CTCs表征中的应用，但该技术存在检测通量低、手动评估耗时等问题。
研究目的
为了解决上述问题，研究团队开发了一种新型的组合双色（Combinatorial Dual-Color, CODuco）原位mRNA检测方法，能够同时分析多达15个不同的标志物。该方法结合了高多重检测能力和显微镜下的单细胞分析，旨在揭示前列腺癌患者CTCs中的多种耐药机制，并提供动态分子变化的监测工具。
研究团队与发表信息
该研究由Lilli Bonstingl、Margret Zinnegger、Katja Sallinger等来自奥地利格拉茨医科大学（Medical University of Graz）的研究团队完成，并于2024年发表在《Biomarker Research》期刊上，文章标题为《Advanced single-cell and spatial analysis with high-multiplex characterization of circulating tumor cells and tumor tissue in prostate cancer: unveiling resistance mechanisms with the CODuco in situ assay》。
研究流程
1. 患者样本采集与伦理审批
研究纳入了晚期转移性前列腺癌患者，所有患者均签署了知情同意书，研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并获得伦理委员会批准。为了避免上皮细胞的污染，研究团队在采集用于细胞分析的血液样本前，先采集了2.5毫升血液用于非细胞分析。
2. 细胞系与PBMCs样本制备
研究使用了前列腺癌细胞系VCaP和PC-3，以及非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299。所有细胞系均按照标准方法培养和固定。健康对照的外周血单核细胞（PBMCs）通过密度梯度离心法分离。
3. CTCs富集与样本制备
CTCs从7.5毫升血液样本中富集，使用Cytogen Smart Biopsy Cell Isolator进行负性选择和基于尺寸的过滤。富集的细胞通过甲醛固定，并转移到显微镜载玻片上。
4. CODuco原位Padlock探针杂交
CODuco原位杂交技术通过靶向逆转录、Padlock探针杂交、滚环扩增和荧光标记的检测探针杂交等步骤，实现了多标志物的同时检测。研究团队设计了针对15个基因的探针，包括造血标志物、上皮标志物、前列腺特异性标志物和神经内分泌标志物。
5. 图像分析与机器学习分类
图像分析使用开源Python库CellProfiler和TissUUmaps进行。研究团队开发了基于随机森林分类器的机器学习模型，用于自动识别CTCs。分类器的训练和测试数据集来自健康对照的血液样本，部分样本中加入了VCaP和PC-3细胞。
6. 组织样本分析
研究还对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行了CODuco原位杂交分析，探索了肿瘤组织中的基因表达模式。
主要结果
1. CODuco原位信号的解码
CODuco方法通过双色编码实现了多达11个标志物的同时检测。研究团队成功解码了CTCs和PBMCs中的原位信号，并展示了不同细胞类型的基因表达谱。
2. CODuco在CTCs表征中的验证
CODuco方法在健康对照的PBMCs、前列腺癌细胞系VCaP和PC-3以及非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299中进行了验证。结果显示，CODuco能够清晰地识别不同细胞类型的基因表达特征，并显著区分PBMCs和肿瘤细胞。
3. 分类器的训练与评估
基于随机森林分类器的机器学习模型在健康对照的血液样本中表现出色，CTCs的召回率（Recall）为0.89，特异性（Specificity）为1.00。在患者样本中，分类器的召回率为0.76，特异性为0.99。
4. 患者CTCs的异质性分析
研究揭示了患者CTCs的异质性，包括CTCs簇的存在和不同患者之间的表达模式差异。例如，患者PC-16的CTCs中检测到了多个CTCs簇，且这些簇的表达模式存在显著差异。
5. CODuco在组织样本中的应用
CODuco方法成功应用于FFPE组织样本，揭示了非肿瘤组织和肿瘤组织中的基因表达差异。与CTCs样本相比，组织样本中的基因表达模式存在显著变化，反映了肿瘤在治疗压力下的进化。
结论
CODuco原位检测方法结合了高多重检测能力和显微镜下的单细胞分析，能够同时识别和表征具有上皮、上皮-间质和神经内分泌表型的CTCs，并可视化CTCs的异质性。该方法在监测前列腺癌患者药物反应和耐药性相关的动态分子变化方面具有显著潜力，尤其是在神经内分泌转分化和PSMA表达检测方面表现出独特的优势。
研究亮点
- 高多重检测能力：CODuco方法能够同时检测多达15个标志物，显著提高了CTCs表征的全面性。
- 神经内分泌转分化的检测：CODuco方法成功检测了神经内分泌标志物，为神经内分泌前列腺癌的早期诊断和治疗提供了新的工具。
- 机器学习辅助的CTCs分类：基于随机森林的分类器能够高效识别CTCs，减少了手动评估的时间和工作量。
- 单细胞分辨率：CODuco方法提供了单细胞水平的基因表达数据，揭示了CTCs的异质性和CTCs簇的存在。
研究意义
该研究为前列腺癌的个体化治疗和耐药性监测提供了新的工具，尤其是在液体活检领域。CODuco方法的开发和应用不仅提高了CTCs检测的灵敏度和特异性，还为揭示肿瘤的异质性和耐药机制提供了新的视角。未来，该方法有望在临床中广泛应用，帮助医生更好地制定治疗方案并监测患者的治疗反应。