学术背景与问题提出

特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）是一种与衰老相关的进行性间质性肺疾病，同时也是肺癌的独立危险因素。流行病学研究表明，3%-22%的IPF患者在随访期间会发展为肺癌，且随着时间推移，肺癌的累积发病率逐渐增加，成为这些患者的主要死亡原因之一。IPF合并肺癌（IPF-LC）的侵袭性显著高于散发性肺癌，尤其是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）是IPF-LC的主要病理类型。然而，目前尚无针对IPF-LC的特定治疗指南，传统的肺癌治疗方法如化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗在临床实践中可能导致IPF急性加重，限制了患者的治疗选择。因此，阐明IPF-LC进展的分子机制对于开发新的治疗靶点至关重要。

近年来，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）引起了广泛关注。CAFs通过重塑细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）和分泌生长因子、细胞因子等促进肿瘤细胞增殖、免疫逃逸、转移和治疗抵抗。研究表明，IPF中的肌成纤维细胞与CAFs有许多相似之处，包括持续的过度激活、异常增殖、间充质特征和相似的信号通路激活。此外，IPF中的成纤维细胞被发现能够促进肿瘤的发生和进展。然而，相关研究数量有限。

细胞衰老（Cellular Senescence）是一种导致细胞周期停滞的不可逆过程，近年来被认为在IPF的发病机制中起重要作用。尽管细胞衰老最初被认为是肿瘤抑制机制，但最近的研究表明，衰老的成纤维细胞可以通过分泌衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）因子促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。因此，研究IPF中衰老的成纤维细胞对NSCLC细胞恶性行为的影响具有重要意义。

论文来源

本论文由Yuqiong Lei、Cheng Zhong、Jingyuan Zhang、Qi Zheng、Yongle Xu、Zhoubin Li、Chenwen Huang和Tao Ren共同撰写，分别来自上海交通大学医学院附属第六人民医院呼吸内科、浙江大学医学院附属第一医院肺移植与胸外科、上海交通大学医学院附属第六人民医院临床研究中心和干细胞中心。论文于2024年发表在《Oncogene》期刊上，DOI为https://doi.org/10.1038/s41388-024-03236-5。

研究流程与结果

1. IPF成纤维细胞的衰老特征

研究首先通过免疫荧光共定位技术检测了IPF患者肺组织中的衰老标志物（γH2AX、p53、p16、p21），发现IPF肺组织中的成纤维细胞、肺泡Ⅰ型细胞（AT1）和肺泡Ⅱ型细胞（AT2）均表现出衰老表型，其中成纤维细胞的衰老比例最高。与健康对照组相比，IPF肺组织中的γH2AX、p53、p16和p21表达显著升高。进一步提取原代成纤维细胞后发现，IPF成纤维细胞（DHLFs）表现出典型的衰老特征，如细胞体积增大、形态不规则、α-SMA和Vimentin表达增加，且增殖能力显著降低。SA-β-gal活性检测进一步证实了DHLFs的衰老特征。

2. 衰老IPF成纤维细胞促进NSCLC增殖和侵袭

通过Transwell间接共培养模型，研究发现与IPF成纤维细胞共培养的NSCLC细胞（A549和SK-MES-1）表现出从鹅卵石样形态向梭形形态的转变，提示上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）。CCK8实验显示，与IPF成纤维细胞共培养的NSCLC细胞增殖能力显著增强。此外，克隆形成实验和Transwell实验表明，IPF成纤维细胞显著增强了NSCLC细胞的克隆形成能力和侵袭迁移能力。Western blot分析显示，IPF成纤维细胞促进了NSCLC细胞中EMT相关蛋白的表达变化，如E-cadherin表达降低，N-cadherin、Vimentin和Snail表达增加。

3. IPF成纤维细胞分泌的外泌体促进NSCLC恶性转化

为了进一步确定IPF成纤维细胞分泌的特定成分对NSCLC细胞表型变化的影响，研究通过差速超速离心法分离了微囊泡（MVs）、外泌体（Exosomes）和无细胞外囊泡（EVs-free）上清液。Western blot检测证实了外泌体的成功提取。CCK8和克隆形成实验显示，外泌体对NSCLC细胞的增殖和克隆形成能力具有最显著的促进作用。透射电镜和纳米颗粒追踪分析（NTA）证实了外泌体的双层囊泡结构和粒径分布（30-150 nm）。荧光标记的外泌体在4小时内被NSCLC细胞内化，24小时内大量摄取。进一步实验表明，IPF成纤维细胞分泌的外泌体显著增强了NSCLC细胞的增殖和克隆形成能力。

4. DHLF外泌体中的SASP因子与NSCLC进展相关

通过质谱分析，研究发现DHLF外泌体中392种蛋白表达上调，其中包括SASP关键成分如FBLN2、IL-6、MMP1、MMP3和IGFBP3。基因本体（GO）富集分析显示，“细胞外外泌体”是最富集的细胞组分，KEGG通路分析显示PI3K-AKT-mTOR信号通路和细胞衰老通路显著富集。单细胞测序数据分析进一步揭示了IPF特异性成纤维细胞亚群，这些亚群表现出更高的衰老评分和与细胞外基质重塑、纤维化相关的蛋白表达。通过SASP因子定量评估，研究发现IPF外泌体中SASP因子表达显著增加，其中MMP1表达差异最为显著。

5. MMP1是DHLF外泌体促进NSCLC进展的关键因子

研究发现，IPF肺组织中的成纤维细胞高表达MMP1，而正常肺组织中的成纤维细胞MMP1表达较低。Western blot和ELISA实验证实，DHLF及其外泌体中MMP1表达显著高于正常成纤维细胞。通过shRNA敲低MMP1表达，研究发现MMP1敲低的外泌体显著减弱了NSCLC细胞的增殖和克隆形成能力。进一步实验表明，MMP1通过激活PAR1受体和PI3K-AKT-mTOR信号通路发挥促肿瘤作用。

6. DHLF外泌体通过PAR1介导的PI3K-AKT-mTOR通路促进肺癌细胞增殖

PAR1是MMP1的广泛受体，研究通过PAR1拮抗剂SCH79797验证了MMP1通过结合PAR1发挥促肿瘤作用。RNA-seq分析显示，DHLF外泌体处理的SK-MES-1细胞中407个基因上调，182个基因下调，GO和KEGG分析表明PI3K-AKT信号通路显著富集。Western blot实验证实，DHLF外泌体显著激活了NSCLC细胞中的PI3K-AKT-mTOR信号通路，而MMP1敲低的外泌体则减弱了这一通路的激活。

7. 外泌体MMP1在体内促进肿瘤生长

通过裸鼠皮下肿瘤形成实验，研究发现DHLF外泌体显著促进了肿瘤生长，而MMP1敲低的外泌体或PAR1抑制剂则有效减弱了这一促肿瘤效应。免疫组化和Western blot分析进一步证实，DHLF外泌体通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路促进了肿瘤生长。

结论与意义

本研究表明，IPF中衰老的成纤维细胞通过分泌携带MMP1的外泌体，激活PAR1和PI3K-AKT-mTOR信号通路，促进了NSCLC的进展。这一发现为IPF-LC患者提供了新的治疗思路，即通过靶向衰老成纤维细胞或关键因子如MMP1和PAR1来抑制肿瘤进展。此外，研究还揭示了外泌体在IPF-LC进展中的重要作用，为未来的治疗策略提供了新的方向。

研究亮点

1. 重要发现：首次揭示了IPF中衰老成纤维细胞通过外泌体MMP1促进NSCLC进展的分子机制。
2. 方法创新：通过质谱分析和单细胞测序技术，系统鉴定了IPF成纤维细胞外泌体中的SASP因子及其功能。
3. 应用价值：研究结果为IPF-LC患者提供了新的治疗靶点，具有重要的临床应用前景。

其他有价值的信息

研究的局限性在于仅关注了外泌体MMP1的促肿瘤作用，未全面探讨外泌体中其他活性成分的作用。未来研究将进一步探讨这些成分在IPF-LC进展中的作用，以发现更多潜在的治疗靶点。此外，研究中IPF患者和健康对照的样本量相对较小，未来计划收集更多样本以提高研究结果的可靠性和有效性。