选择性基因驱动器编程肿瘤进化以主动对抗药物耐药性

随着肿瘤的发展，针对癌症的靶向疗法通常会因药物抵抗性的进化而失败。本研究展现了一种可重复操纵肿瘤进化以设计治疗机会的方式，即使在遗传异质性预先存在的情况下。我们开发了一种选择性基因驱动器系统，可以稳定地引入到癌细胞中，由两个基因（或开关）组成，将可诱导的适应性优势与共享的适应性成本相耦合。利用随机模型的进化动力学，我们确定了选择性基因驱动器的设计准则，并建造了可以利用多个已批准的酪氨酸激酶抑制剂选择性压力的原型，并采用了多种治疗机制，如前药催化和免疫活性诱导。我们证明选择性基因驱动器能在体外消除多种形式的遗传抗性。最终，我们展示了在小鼠实体瘤模型中，模型引导的开关激活可以有效针对预先存在的抗性。这些结果为进化引导的抗癌治疗确立了选择性基因驱动器作为一个强大的框架。

对于许多癌症而言，药物耐药性进化是发展根治性抗癌疗法的最大挑战之一。单细胞异质性研究已揭示出小的耐药亚克隆通常在基线时就存在于肿瘤中，这表明大多数病例将导致治疗失败。此外，对数百例晚期肺癌患者的最近研究发掘出惊人的基础遗传多样性水平，而且揭示了如何对抗这种深刻的异质性的少量线索。药物治疗显著改变了肿瘤的进化景观，其结果往往是形成对药物难以应对且可选择的肿瘤，其治疗选择变得更少。

对抗抵抗性的努力受到了抵抗性进化固有不确定性的阻碍。在大多数情况下，抵抗性变异体在治疗开始时过于稀少而无法可靠检测，因此肿瘤的进化轨迹无法预测。因此，传统对抗抵抗性的方法涉及等待亚克隆长到足够大到可以临床检测的程度，然后用适当的治疗策略进行响应。在靶向治疗的情况下，如果抵抗性由靶基因的点突变驱动，这种策略通常意味着开发并响应新一代抑制剂。例如，在EGFR突变型非小细胞肺癌(NSCLC)中，如果肿瘤在一线治疗中使用了TKI厄洛替尼，而获得了T790M耐药突变，则表明新一代酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼。然而，这些新一代治疗通常只能提供暂时的反应。在一线治疗期间等待抵抗性增长为肿瘤提供了足够的时间和选择性压力，使其可以出现二级抵抗性。

我们提出了一种“前向工程”治疗策略，即通过基因改变癌细胞，利用小分子药物将肿瘤的进化景观反转，选择改变的癌细胞而不是抵抗性亚克隆。在重新设计肿瘤时，我们可以利用药物选择性生成更多的治疗机会，而不是更少。

灵感来自于基于CRISPR的系统控制疾病载体进化，我们将这种方法称为“双开关选择性基因驱动器”。基因电路由两个基因或“开关”组成，它们通过一个载体稳定地引入到癌细胞中。这个模块化平台的基本功能是将可诱导的适应性优势（开关1）与共享的适应性成本（开关2）耦合在一起。开关1充当合成抗性基因，赋予暂时的抗性表型，扩大治疗期间工程细胞的频率。开关2是治疗性负载基因。如同标准GDEPT一样，它激活能杀死工程化和未改造的癌细胞的可扩散治疗物。这种旁观者效应通过对开关1基因的搭便车而增强，从而最大化自杀基因的治疗潜力。这种旁观者活性不受开关1治疗阶段选择的任何本地抵抗种群的影响。另外，由于开关2活性理论上仅限于肿瘤环境，可能会获得比全身给药更高的活性剂局部浓度。通过促进更强有力的治疗行为，最大化地减少了交叉抵抗的风险，并充分实现了联合治疗的承诺。

我们在这篇文章中，使用模型引导的设计构建并评估了双开关选择性基因驱动器用于抗癌治疗。通过设计可控的药物靶标类似物，我们展示了多个生物学背景中的开关1活性。此外，我们建立了GDEPT和免疫版本开关2基因的治疗功能和旁观者杀伤效果。我们的完整双开关电路展示了消除预先存在的抵抗性的能力，包括在药物靶标和全基因组内的复杂遗传库抗性变异。最终，模型引导的开关激活在活体中展示了强大的疗效，强调了利用进化原理而不是对抗它们的好处。总的来说，我们的发现支持了选择性基因驱动器植根于进化理论的概念框架，可以用来重新设计肿瘤和靶向多样的本地遗传异质性。

研究结果显示，引入并选择遗传结构会为肿瘤群体引入更多的异质性，并有意扩大基因改造的癌细胞群体。为了评估这种违反直觉的治疗方法的进化风险，我们制定了一个随机的肿瘤进化机制模型。这样一种模型可以预见并调查与选择性基因驱动器系统相关的进化风险。此外，了解在选择下的预期进化动力学有助于制定关键的系统设计标准。这些标准涵盖了实现进化控制所需的假设基因传递效率以及开关1治疗阶段基因驱动细胞的适应性。

模型考虑了一个初始时敏感的小癌细胞群体，这些细胞扩张直至在肿瘤被检测到时，有一部分肿瘤细胞被改造成为基因驱动器细胞，治疗就此开始。在开关1阶段的治疗维持到基因驱动器细胞成为主导群体后，开关2治疗开始。在整个仿真过程中，突变事件产生了子克隆模型，模拟了潜在的系统失败点。这些突变包括获得对靶向治疗的抗性、对开关2基因的治疗活性的抗性以及基因驱动细胞中开关2活性的损失。

此外，我们希望评估选择性基因驱动器系统的可能空间风险。特别是，治疗性开关2基因的旁观者效应需要与未改造细胞的近邻来清除它们。因此，我们预计基因驱动细胞的空间分布和旁观者活动的范围将是治疗成功的重要决定因素。为了预期空间失败源，我们构建了一个选择性基因驱动器系统的空间代理模型。该模型考虑了敏感细胞、抵抗细胞和基因驱动细胞的混合群体。然而，基因驱动细胞根据空间弥散参数进行播种。

在这项研究中，我们提出了使用模型测试的设计标准来确定基因驱动器系统在更广泛的背景下是否具有可行性。相对于临床示范，结果表明，即使基因传递率很低，也可能实现进化控制。除此之外，即使基因驱动细胞相对于天然抵抗群体适应性较差，仿真结果也表明可能实现进化控制。这是因为，即使基因传递率很低，预计在治疗开始时，基因驱动细胞的数量比抵抗性子克隆多几个数量级。

纵观全局，这些模型结果探索了具有生理合理参数的许多可想的失败模式，并预测了正向工程肿瘤群体的成功可能性。然而，选择性基因驱动器治疗预计将在所有情况下延长无进展生存期，并在大多数条件下增强根除潜力。此外，模型研究表明，与各种不同的分散和旁观者参数进行部分独立的模拟结果，选择性基因驱动器系统在旁观者活动分散时受益。

理论上的隔室和空间代理模型表明，选择性基因驱动器是一种朝着实现进化控制的有效途径，因此我们根据理论结果设计并组装了基因结构。制造适用于现有标准护理治疗并能够利用进化原则根除异质性预先存在形式的基因结构是可行的。

我们的原始原型基因构建是可以控制的，使用的分子零件是那些已在人类中被证明是安全的，并且基因驱动器行为与定量模型相符。此外，我们展示了选择性基因驱动器图案的模块化，不同的开关设计证明了在不同药物和肿瘤类型中具有可诱导的适应性优势。交替式开关2系统，包括免疫介导的抗癌机制，展示了强大的旁观者活性。为了展示我们的方法在遗传多样性和空间失败模式面前的进化稳健性，我们展示了选择性基因驱动器可以根除药物靶标内部和整个基因组内广泛层次的遗传异质性。最后，通过使用进化模型来优化体内开关的动态，我们将这些发现应用于体内药物动力学实验，以展示双开关功能的有效性。

所有我们在体外和体内所做的实验都在一个大型的、超生理水平的预先存在的抵抗性细胞群体中进行。因此，我们的模型驱动设计预计将在可能迅速治疗失败的肿瘤细胞群体上取得进化控制。

选择性基因驱动器技术建立在逐步涌现的以进化为导向的治疗领域的前进基础上。选择性基因驱动器治疗方法的一个主要考虑是交付。理论上，肿瘤细胞可以在体内被改造来表达遗传电路。用非切除的局部晚期肿瘤进行局部交付提供了一个低门槛来开始转化。

我们论证了选择性基因驱动器这种概念框架，该框架可以重新定向肿瘤的进化，以制造更具治疗性的状态。我们最初的选择性基因驱动器设计使用随机进化模型进行验证，表现出可预见的领域，对遗传和空间故障模式相当鲁棒。尽管选择性基因驱动器有风险，但在治疗晚期肿瘤时的棘手问题和肿瘤基线上的巨大遗传多样性需要大胆的新方法。通过利用进化模型，我们可以设计肿瘤，可靠且有效地针对其自身的异质性。